大腸桿菌表達系統(tǒng)
雖然目前應(yīng)用最為廣泛，
但在需要可溶性蛋白時，
得到的卻有可能是包涵體。
或許，
我們可以先了解一下包涵體到底是啥

↓
包涵體(Inclusion Body)是外源基因在原核細胞中表達時，尤其是在大腸桿菌中高效表達時，形成的由膜包裹的高密度（1.3 mg/ml）不溶性蛋白質(zhì)顆粒，在顯微鏡下觀察時為高折射區(qū)，與胞質(zhì)中其他成分有明顯區(qū)別。


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包涵體示意圖

包涵體一般含有50%以上的重組蛋白，其余為核糖體元件、RNA聚合酶、內(nèi)毒素、外膜蛋白以及脂體、脂多糖等，只溶于變性劑如尿素、鹽酸胍等。

包涵體大小為0.5-1 um左右，大腸桿菌細胞質(zhì)中的包涵體直徑一般在0.2 μm到1.5 μm之間。不同的蛋白質(zhì)具有不同的直徑，如干擾素的大小是0.811 μm，而牛凝乳酶原的大小是1.281 μm。在一些情況下，有些包涵體比較大，直徑大于大腸桿菌的直徑，使得大腸桿菌有一個突起。大的包涵體可以利用光學顯微鏡看到。一般情況下，一個細胞僅有一個包涵體。包涵體從來不吸附在膜上，并且不同于真核細胞中的其他細胞器。高精度的投射電子顯微鏡顯示了低分子量包涵體的多孔結(jié)構(gòu)。

還有一種叫做

↓病毒包涵體

病毒在增殖的過程中，常使寄主細胞形成一種蛋白質(zhì)性質(zhì)的病變結(jié)構(gòu)，在光學顯微鏡下可見，多為圓形、卵圓形或不定形。一般是由完整的病毒顆?；蛏形囱b配的病毒亞基聚集而成，少數(shù)則是宿主細胞對病毒感染的反應(yīng)產(chǎn)物，不含病毒粒子。有的位于細胞質(zhì)中（如天花病毒包涵體），有的位于細胞核中（如皰疹病毒），或細胞質(zhì)、細胞核中都有（如麻疹病毒）。有的還具有特殊名稱，如天花病毒包涵體叫顧氏（Guarnieri）小體，狂犬病毒包涵體叫內(nèi)基氏（Negri）小體。細胞中的生物學活性蛋白質(zhì)常以可溶性或分子復(fù)合物的形式存在，功能性的蛋白質(zhì)總是折疊成特定的三維結(jié)構(gòu)型。而包涵體內(nèi)的蛋白是非折疊狀態(tài)的聚集體，因此不具有生物學活性。

↑
這也是包涵體讓人頭疼的原因。

那么，
它是怎樣形成的呢？
↓ 包涵體形成的原因 

包涵體之所以形成可能與重組蛋白在表達過程中缺乏某些折疊輔助因子或環(huán)境不適無法形成正確的次級鍵有關(guān)。
01表達量過高
研究發(fā)現(xiàn)在低表達時很少形成包涵體，表達量越高越容易形成包涵體。可能是合成速度太快以至于沒有足夠的時間進行蛋白折疊，二硫鍵不能正確配對，過多蛋白間的非特異性結(jié)合，蛋白質(zhì)無法達到足夠的溶解度等。
02氨基酸組成
一般含半胱氨酸越多的重組蛋白越易形成包涵體，而脯氨酸的含量明顯與包涵體的形成呈正相關(guān)。
03所處的環(huán)境
發(fā)酵溫度高或胞內(nèi)pH接近蛋白的等電點時容易形成包涵體。
04蛋白的來源

重組蛋白是大腸桿菌的異源蛋白，由于缺乏真核生物蛋白翻譯后修飾所需酶類，致使中間體大量積累，容易形成包涵體沉淀。因此有人采用共表達分子伴侶的方法以增加可溶蛋白的比例。

05包涵體形成的位置 
蛋白包涵體是一個廣泛存在的現(xiàn)象，在大腸桿菌中，包涵體可在細胞的兩個位置出現(xiàn)：細胞質(zhì)和外周胞質(zhì)。通常認為蛋白的聚集無論出現(xiàn)在細胞內(nèi)還是細胞外，都是由于中間體不能完成折疊導致的。

包涵體在細胞內(nèi)形成的位置和特點
取決于蛋白表達的方式。
當大量表達時，三種不同的（天然的、含有OmpA信號肽的和完全切除天然信號肽的）內(nèi)酰氨酶都形成了包涵體，但前兩者的包涵體在外周胞質(zhì)，后者卻在細胞質(zhì)內(nèi)。這些包涵體的大小和形狀有相當清楚的差別，這些差別表現(xiàn)在包涵體的表面形態(tài)、組成和多肽鏈構(gòu)象上。

  包涵體的純化 

包涵體的純化主要有以下幾個步驟：
1
收菌破碎
細菌發(fā)酵液高速離心收集菌體，經(jīng)超聲破碎或者裂解液處理后，高速離心收集沉淀。
2洗滌
用低濃度的變性劑如2 M尿素在50 mM Tris ，pH 7.5條件下洗滌包涵體，除去包涵體上粘附的雜質(zhì)，此外可以用溫和去垢劑TritonX-100洗滌去除膜碎片和膜蛋白。該步驟一定要作用溫和，過高濃度的尿素或鹽酸胍會使包涵體溶解而無法粗純將雜質(zhì)分離。
3
變性溶解
一般用強的變性劑如尿素、鹽酸胍，通過離子間的相互作用，打斷包涵體蛋白分子內(nèi)和分子間的各種化學鍵，使多肽伸展。通常而言鹽酸胍優(yōu)于尿素，兩者比較如下所示：
 優(yōu)點
 尿素（8 M-10 M）：尿素溶解不電離，呈中性，成本低，蛋白復(fù)性后除去不會造成大量蛋白沉淀；溶解后的包涵體可選用多種色譜方法純化。
鹽酸胍（6 M-8 M）：溶解能力強，高達95%以上，溶解作用快而不造成重組蛋白的共價修飾。
 缺點 

尿素（8M-10M）：較鹽酸胍慢而弱，溶解度為70%-90%。
鹽酸胍（6M-8M）：成本高，酸性條件下易形成沉淀，復(fù)性后除去可能造成蛋白大量沉淀；對蛋白離子交換色譜有干擾。

  包涵體的復(fù)性

 由于包涵體中的重組蛋白缺乏生物學活性，加上劇烈的處理條件，使蛋白的高級結(jié)構(gòu)破壞，因此重組蛋白的復(fù)性特別重要。通過緩慢去除變性劑使目標蛋白從變性的完全伸展狀態(tài)恢復(fù)到正常的折疊結(jié)構(gòu)，同時去除還原劑使二硫鍵正常形成。一般在尿素濃度4M左右時復(fù)性過程開始，到2M左右時結(jié)束。對于鹽酸胍而言，可以從4M開始，到1.5M 時復(fù)性過程結(jié)束。

復(fù)性是一個非常復(fù)雜的過程，除與蛋白復(fù)性的過程控制相關(guān)外，還很大程度上與蛋白本身的性質(zhì)有關(guān)：有些蛋白非常容易復(fù)性，如牛胰RNA酶有12對二硫鍵，在較寬松的條件下復(fù)性效率可以達到95%以上，而有一些蛋白至今沒有發(fā)現(xiàn)能夠?qū)ζ溥M行復(fù)性的方法，如IL-11。很多蛋白的復(fù)性效率只有百分之零點幾。一般來說，蛋白質(zhì)的復(fù)性效率在20%左右。影響復(fù)性效率的因素有蛋白質(zhì)的復(fù)性濃度，變性劑的起始濃度和去除速度、溫度、pH、氧化還原電勢、離子強度、共溶劑和其他添加劑的存在與否等。常用的復(fù)性方法有以下幾種。

 稀釋復(fù)性 

用復(fù)性緩沖液快速稀釋溶解的包涵體蛋白溶液，降低變性劑濃度簡單地使去折疊的蛋白進行再折疊。優(yōu)點：操作簡單。
缺點：慢，體積增加很大，變性劑稀釋速度太快不易控制，蛋白會被稀釋到很低濃度。 

透析復(fù)性 

通過逐漸降低外透液濃度來控制變性劑的去除速度達到使包涵體復(fù)性的目的。
優(yōu)點：操作簡單，不增加體積。
缺點：慢，使用大量的緩沖液，不適合大規(guī)模大批量的復(fù)性操作。

 凝膠過濾層析 

利用分子篩效應(yīng)將蛋白質(zhì)和小分子變性劑分離，實現(xiàn)溶液交換和蛋白質(zhì)的再折疊。優(yōu)點：一步操作，直接自動化完成蛋白復(fù)性和純化，簡單快捷。
缺點：樣品體積受限制，若復(fù)性失敗則預(yù)裝柱會被堵死廢棄。 

離子交換層析

 減少導致蛋白聚集的分子間相互作用，將蛋白質(zhì)結(jié)合在分離介質(zhì)上從而達到使溶液中變性劑濃度稀釋和蛋白質(zhì)純化的目的。
優(yōu)點：快速并簡單，直接進行，操作自動化。
缺點：操作應(yīng)避免使用與離子交換相反電荷的物質(zhì)。

  復(fù)性效率的檢測 

根據(jù)具體的蛋白性質(zhì)和需要，可以從生化、免疫、物理性質(zhì)等方面對蛋白質(zhì)的復(fù)性效率進行檢測。主要的檢測方法有以下幾種：
01凝膠電泳
一般用非變性的聚丙烯酰胺凝膠電泳可檢測變性和天然狀態(tài)的蛋白質(zhì)，或用非還原的聚丙烯酰胺電泳檢測有二硫鍵的蛋白復(fù)性后二硫鍵的配對情況。
02光譜學方法
可以用紫外差光譜、熒光光譜、圓二色性光譜（CD）等，利用兩種狀態(tài)下的光譜學特征進行復(fù)性情況的檢測，但一般只用于復(fù)性研究中的過程檢測。
03色譜方法
如IEX、RP-HPLC、CE等，因為兩種狀態(tài)的蛋白色譜行為不同。
04生物學活性及比活測定
一般用細胞方法或生化方法進行測定，較好地反映了復(fù)性蛋白的活性。值得注意的是，不同的測活方法測得的結(jié)果不同，而且常常不能完全反映體內(nèi)活性。
05黏度和濁度測定
復(fù)性后的蛋白溶解度增加，變性狀態(tài)時由于疏水殘基暴露，一般水溶性很差，大多形成可見的沉淀析出。
06免疫學方法
如ELISA、Western等，特別是對結(jié)構(gòu)決定簇的抗體檢驗，比較真實地反映了蛋白質(zhì)的折疊狀態(tài)。

雖然我們都不怎么喜歡包涵體，
但它也不是一無是處
↓ 包涵體也有優(yōu)越性 

在下游生產(chǎn)過程中特別是在醫(yī)藥生產(chǎn)中，以包涵體形式表達的蛋白具有一些優(yōu)越性。

 01 異源表達的蛋白很容易被宿主細胞內(nèi)的蛋白酶降解，如果以包涵體形式表達，由于酶攻擊的位點被包埋了，可最大限度地抵抗蛋白酶的攻擊。

 02 由于包涵體表達的蛋白沒有活性，細胞破碎和后續(xù)的純化步驟不用考慮蛋白的失活問題。

 03 包涵體蛋白與宿主細胞其他蛋白的分離比可溶蛋白的分離方法簡便且造價低，使用簡單的離心或過濾的手段就能使包涵體與宿主細胞的其他蛋白成分有效分離。

 04 有些外源蛋白對細胞有毒或能致死，大量表達會導致細胞死亡，使最終的細胞數(shù)量和產(chǎn)物相當?shù)?，而包涵體形式的蛋白質(zhì)由于喪失了生物活性從而可以高效大量地表達。

 05 對于以包涵體形式表達的產(chǎn)物比較容易進行在線觀測定性，含有包涵體蛋白質(zhì)的細胞有較大的折射率，不必像可溶的蛋白質(zhì)需要細胞破碎后使用酶學或者電泳學的方法進行鑒定。  最后 

Renaturation is an art form and no standard protocol exists。


相信隨著結(jié)構(gòu)生物學、生物信息學、蛋白質(zhì)工程學及相關(guān)新技術(shù)和新設(shè)備的發(fā)展和完善，在不久的將來，預(yù)測和設(shè)計最佳復(fù)性方案將成為可能。