雙特異性抗體(biospecific antibody， heteroconjugate antibodies)是一類具有雙功能的雜交抗體分子，具有兩個(gè)不同的抗原特異性結(jié)合的Fab段，能與不同的配體結(jié)合，通過(guò)特異性結(jié)合腫瘤抗原同時(shí)結(jié)合不同的效應(yīng)細(xì)胞和分子，達(dá)到定向殺傷腫瘤細(xì)胞的作用。

1.1含有Fc區(qū)的雙特異性抗體

抗體的Fc結(jié)構(gòu)域的生物學(xué)功能有：抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用(ADCC)和補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用(CDC)。雙特異性抗體的制備技術(shù)手段有以下幾種：

Triomabs：Triomabs通過(guò)Fv功能區(qū)分別結(jié)合腫瘤細(xì)胞及T細(xì)胞，通過(guò)Fc功能區(qū)募集表達(dá)FcR的功能細(xì)胞，如NK細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、粒細(xì)胞及樹突狀細(xì)胞等，形成復(fù)合體，刺激T細(xì)胞分泌細(xì)胞因子清除腫瘤細(xì)胞，因此Triomabs又被稱為三功能抗體。Triomabs雙特異性抗體技術(shù)平臺(tái)由德國(guó)Fresenius和Trion Pharma公司合作開發(fā)。

Knobs-into-holes：這項(xiàng)技術(shù)由Genentech公司開發(fā)。具體方法是將其中一個(gè)抗體的重鏈CH3區(qū)366位體積較小的蘇氨酸(T)突變?yōu)轶w積較大的酪氨酸(Y) ，形成突出的“Knobs”型結(jié)構(gòu)(T366Y);同時(shí)將另一個(gè)抗體重鏈CH3區(qū)407位較大的酪氨酸(Y)殘基突變成較小的蘇氨酸(T)，形成凹陷的“holes”型結(jié)構(gòu)(Y407T) ; 利用“Knobs-into-holes”結(jié)構(gòu)的空間位阻效應(yīng)實(shí)現(xiàn)兩種不同抗體重鏈間的正確裝配。突變后，產(chǎn)品正確裝配率由野生型的57%提高至92%，能夠滿足規(guī)?；a(chǎn)的要求。但重鏈CH3的這一改構(gòu)方式降低了抗體結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，為了克服這一缺點(diǎn)，研究者通過(guò)噬菌體展示技術(shù)進(jìn)行隨機(jī)突變篩選，構(gòu)建了更為穩(wěn)定的“3 + 1”模式Knobs-holes結(jié)構(gòu) : 即T366W突變形成突出的“Knobs”型，3個(gè)氨基酸突變(T366S，L368A和Y407V)形成凹陷的“holes”型。Knobs-holes結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)有利于2種異源抗體重鏈的裝配。

Crossmab: Crossmab技術(shù)的代表產(chǎn)品為羅氏公司的RG7221和RG7716，兩者均為抗Ang-2/VEGF雙特異性抗體。其結(jié)構(gòu)是在“knobs-holes”結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上通過(guò)鏈交換技術(shù)，將Ang-2抗體Fab結(jié)構(gòu)域中的CL與CH1互換，而VEGF抗體的Fab結(jié)構(gòu)則保持不變。經(jīng)過(guò)改造的Ang-2抗體輕鏈不易與血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子( VEGF)抗體的重鏈發(fā)生錯(cuò)配，同時(shí)“knobs-holes”結(jié)構(gòu)可促進(jìn)兩條重鏈異源二聚化。

Ortho-Fab:該技術(shù)是Lewis等報(bào)道的一種克服輕鏈錯(cuò)配的設(shè)計(jì)策略。Lewis等通過(guò)計(jì)算機(jī)模型化并結(jié)合X晶體衍射技術(shù)對(duì)VH/VL及CH1/CL進(jìn)行正交互補(bǔ)突變?cè)O(shè)計(jì)，從而減少輕鏈錯(cuò)配現(xiàn)象，將此技術(shù)結(jié)合重鏈異源二聚化方法，可以實(shí)現(xiàn)雙特異性抗體在單一細(xì)胞內(nèi)的高效表達(dá)。近期，靜電轉(zhuǎn)向技術(shù)(electrostatic steering)也被應(yīng)用進(jìn)行Orthogonal Fab雙特異性抗體的構(gòu)建。

IgG-scFv及scFv2-Fc：IgG-scFv雙特異性抗體是將單鏈抗體(scFv)連接在正常IgG抗體分子的C末端，通過(guò)分子兩端的CDR區(qū)與靶分子結(jié)合實(shí)現(xiàn)雙功能。而scFv2-Fc分子與IgG-scFv結(jié)構(gòu)類似，是將兩個(gè)scFv分子分別連接在Fc功能區(qū)的兩端，形成雙功能區(qū)。

1.2不含F(xiàn)c區(qū)的雙特異性抗體

另一類雙特異性抗體不含F(xiàn)c區(qū)，其優(yōu)點(diǎn)是相對(duì)分子質(zhì)量小、可以在原核細(xì)胞中表達(dá)且更易穿過(guò)組織及腫瘤細(xì)胞到達(dá)靶位點(diǎn) ; 缺點(diǎn)是由于不含抗體Fc區(qū)，不能介導(dǎo)相應(yīng)的生物學(xué)功能且半衰期通常較短，如已上市的Blinatumomab血液半衰期只有2.11h，需要通過(guò)注射泵連續(xù)給藥28d。目前，此類雙特異性抗體主要有BiTE，DART，TandAbs，bi-Nanobody等。

BiTE雙特異性抗體：德國(guó)Micromet公司開發(fā)的BiTE系列產(chǎn)品是不含F(xiàn)c區(qū)結(jié)構(gòu)類雙特異性抗體的典型代表。BiTE是將抗CD3單鏈抗體(scFv)與不同抗腫瘤細(xì)胞表面抗原的單鏈抗體通過(guò)肽段進(jìn)行連接而獲得，可同時(shí)結(jié)合CD3陽(yáng)性T細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞。BiTE通過(guò)結(jié)合T細(xì)胞表面CD3，將T細(xì)胞募集至腫瘤細(xì)胞表面，從而激活T細(xì)胞進(jìn)行腫瘤殺傷。

BiTE技術(shù)研究者克服了scFv穩(wěn)定性差、表達(dá)量低、溶解性低等生產(chǎn)問(wèn)題，成功實(shí)現(xiàn)了BiTE產(chǎn)品的商業(yè)化。bi-Nanobody雙特異性抗體：Nanobody是Ablynx 公司參考駱駝及美洲駝的單域抗體結(jié)構(gòu)(無(wú)輕鏈及CH1區(qū))，通過(guò)結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)化，僅保留VH區(qū)而開發(fā)的專利平臺(tái)技術(shù)。在實(shí)際應(yīng)用中，Nanobody是將2個(gè)或多個(gè)抗體分子的VH區(qū)進(jìn)行連接而實(shí)現(xiàn)多特異性結(jié)合。該類產(chǎn)品的主要優(yōu)點(diǎn)是分子小、穩(wěn)定性高、易于人源化、易于連接，并可通過(guò)多種途徑進(jìn)行給藥。此外，在分子設(shè)計(jì)時(shí)可選擇加入與人血白蛋白結(jié)合的功能區(qū)，將半衰期延長(zhǎng)至2～3周，并且可以通過(guò)白蛋白將藥物運(yùn)輸至靶位點(diǎn)。

普健生物具有經(jīng)驗(yàn)豐富的雙特異性抗體制備團(tuán)隊(duì)，能夠提供以上雙特異性抗體類型的設(shè)計(jì)