很多人不知道，抗體藥物研發(fā)，最關(guān)鍵的一步是。。。

咨詢，問對人很重要

一個雙特異性抗體藥與普健的故事，四年征程，未完待續(xù)。。。

那是風(fēng)和日麗的一個下午，叮咚~

一條消息跳了出來，“要開發(fā)雙特異性抗體藥物，你們有專家嗎？”

“我們的抗體藥物專家經(jīng)驗豐富，曾經(jīng)成功開發(fā)過上市治療性抗體藥物，可以針對具體需求進(jìn)行個性化設(shè)計。AtaGenix將全程為您服務(wù)。” 

隨后，一項歷時四年的工程由此展開。

 

01明確客戶需求

 

目標(biāo)：開發(fā)一種雙特異性抗體藥物，通過連接CD3抗體，增強(qiáng)針對某類特定腫瘤細(xì)胞A的免疫系統(tǒng)識別能力。

 

02探索實現(xiàn)途徑  

 

要開發(fā)雙特異性抗體，我們得先分別獲得抗單種抗原的鼠單抗---CD3抗體和腫瘤抗原A的抗體。然后進(jìn)行雙特異性抗體設(shè)計、表達(dá)及純化，對正確組裝后的雙抗進(jìn)行檢測，最終實現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)。

路得一步一步走，每一步都很關(guān)鍵。

 

Step.1獲得抗腫瘤抗原A的抗體

 

這就需要我們的單克隆抗體開發(fā)技術(shù)（點擊可查看技術(shù)詳情）。

要求：得到的單克隆抗體可用于流式細(xì)胞術(shù)（FC）檢測特定的人細(xì)胞膜蛋白。這些抗體將被用于人類細(xì)胞和小鼠的體外試驗。 

已知目標(biāo)蛋白在哺乳動物表達(dá)系統(tǒng)里很難表達(dá)，但我們就是解決困難的。 

接下來，沿著單克隆抗體開發(fā)流程，看一下我們是怎樣做到的。

01

抗原制備

經(jīng)過預(yù)測和評估，我們選擇了目標(biāo)蛋白的一個片段在哺乳動物細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)。

雖然，該基因是針對哺乳動物細(xì)胞表達(dá)而設(shè)計和優(yōu)化的。

但是，我們向來不只做單一準(zhǔn)備，永遠(yuǎn)備有為客戶準(zhǔn)備的Plan B。So，除了哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，我們還選了大腸桿菌作為備用系統(tǒng)。兩種表達(dá)方案同時進(jìn)行，最終獲得滿足條件的抗原。

02

動物免疫及篩選

用原始抗原免疫五只小鼠，并篩選陽性血清。

為了篩選到符合要求的抗體，我們將綠色熒光蛋白GFP與抗原蛋白在哺乳動物細(xì)胞中融合表達(dá)，通過FITC信號將表達(dá)GFP的細(xì)胞篩選出來，作為流式分析抗體特異性的陽性細(xì)胞；并使用能夠識別GFP的一抗作為陽性抗體對照，來篩選特異性抗體。

流式分析檢測結(jié)果(GFP抗體和GFP陽性細(xì)胞百分比)：

流式檢測中對抗原免疫原性最強(qiáng)的為3號小鼠血清，4號次之，我們決定對小鼠3號和4號進(jìn)行融合。

03

細(xì)胞融合、亞克隆及生產(chǎn)

將篩選出的兩只小鼠脾細(xì)胞分別進(jìn)行融合、亞克隆，F(xiàn)C檢測保留最佳陽性抗體，最終獲得最佳的30株抗腫瘤抗原A候選單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株。

看一下我們都做了哪些工作?

a. 對3號小鼠細(xì)胞融合后的上清，進(jìn)行ELISA檢測，從中篩選出42株陽性細(xì)胞株（下表）。

b. 對3號小鼠細(xì)胞融合后的上清，進(jìn)行FC檢測，從中篩選出14株陽性細(xì)胞株（下表）。

c. 生產(chǎn)的抗體，進(jìn)行FC檢測，從中篩選出30株陽性細(xì)胞株（下表）。

每一步融合、亞克隆，都進(jìn)行ELISA和FC檢測，數(shù)據(jù)過多，一一羅列怕是要打我嘍~努力總會有回報的！

小結(jié)

經(jīng)過多系統(tǒng)表達(dá)測試，我們成功地在哺乳動物細(xì)胞中重組表達(dá)了目標(biāo)抗原，開發(fā)出對抗原具有良好親和力和特異性的單克隆抗體。最終，我們生產(chǎn)并純化得到了30株抗腫瘤抗原A抗體的單克隆細(xì)胞株，產(chǎn)生的抗體均可以在流式細(xì)胞術(shù)中成功識別抗原。

 

 

Step.2單克隆抗體測序

 

抗腫瘤抗原A雜交瘤測序獲得鼠單抗的VH和VL序列。

 

Step.3嵌合抗體表達(dá)驗證

 

做了8個嵌合抗體的表達(dá)純化，將8個嵌合抗體和1個原始雜交瘤細(xì)胞純化得到的抗體進(jìn)行ELISA驗證，用Biacore檢測了這9個抗體的親和力，篩選到了高親和力的嵌合抗體。

 

Step.4抗體人源化

 

表達(dá)了18個人源化抗體，將18個人源化抗體、原始雜交瘤細(xì)胞純化得到的抗體及篩選得到的最佳嵌合抗體，進(jìn)行ELISA驗證，用Biacore檢測了這20個抗體的親和力，篩選得到高親和力抗體。

接下來，是最關(guān)鍵的一步。別眨眼哦！

 

Step.5雙特異性抗體開發(fā)

 

目標(biāo)：抗腫瘤抗原A和CD3的雙特異性抗體

01

不同類型雙特異性抗體設(shè)計

我們已獲得3個抗腫瘤抗原A抗體，1個抗CD3抗體。

AB1（前期項目中開發(fā)并測序的小鼠雜交瘤單克隆抗體）

AB2和AB3（通過噬菌體展示開發(fā)的人源單克隆抗體）

AB4 （AB4h）是在專利中公開的的抗CD3人源化抗體

我們的抗體設(shè)計專家設(shè)計了3種類型的雙特異性抗體，即CrossMAb，IgG-like format using DuoBodies，and IgG-like bivalent Fab-Fab-Fc format。 

02

基因合成和亞克隆

將cDNA序列亞克隆到AtaGenix特有的哺乳動物細(xì)胞表達(dá)載體pTXs1中，本項目共使用21個表達(dá)質(zhì)粒（下表）：

03

重組雙特異性抗體小規(guī)模表達(dá)純化測試

總共16種抗腫瘤抗原A和抗CD3的重組抗體片段用于測試。

表達(dá)測試結(jié)果如下：

CrossMAbs類型重組抗體表達(dá)純化測試

結(jié)果表明，CrossMAbs是表達(dá)的，但沒有以完整的雙特異性抗體結(jié)構(gòu)組裝，處于半形成狀態(tài)。

DuoBodies類型重組抗體表達(dá)純化測試

No.7: AB1重組抗體；No.8: AB2重組抗體；No.9: AB3重組抗體；No./10: AB4重組抗體

Bivalent Fab-Fab類型重組抗體表達(dá)純化測試

重組抗體QC結(jié)果（還原膠和非還原膠）

結(jié)果顯示，對于DuoBodies和Bivalent Fab-Fab抗體類型，正確地產(chǎn)生了完整的雙特異性抗體結(jié)構(gòu)。

值得一提的是，我們整個表達(dá)純化過程對內(nèi)毒素進(jìn)行了有效的控制和去除，將內(nèi)毒素控制在<0.1EU/mg。

04

Fab臂交換重組DuoBodies

上面獲得的DuoBodies類型重組抗體，目前只能特異識別單一抗體，如何將兩種抗體組合連接，就需要神奇的Fab臂交換技術(shù)。

通過特定的條件，進(jìn)行Fab臂交換重組抗腫瘤抗原A抗體和抗CD3抗體，形成雙特異性抗體。

對交換重組的雙特異性抗體進(jìn)行檢測：

重組DuoBodies抗體QC結(jié)果（還原膠和非還原膠）

1：No.7+No./10；2：No.8+No./10；3：No.9+No./10

重組DuoBodies抗體產(chǎn)量及純度

05

重組雙特異性抗體檢測分析

5.1）SEC-HPLC Analysis

SEC-HPLC檢測結(jié)果表明，No.7+No./10重組雙特異性抗體濃度最高，是由兩個重鏈和兩個輕鏈組成的理想雜合四聚體。No.8+No./10重組抗體有一些降解或未組裝完全，No.9+No./10重組抗體顯著降解或組裝較少。

5.2）ELISA滴定

ELISA滴定法同時測定雙特異性抗體和以前獲得的親本抗體(AB1、AB2和AB3)對腫瘤抗原A和CD3的結(jié)合能力。

針對腫瘤抗原A結(jié)合檢測

針對CD3結(jié)合檢測

檢測結(jié)果顯示，所有陽性對照與預(yù)期一致。

DuoBodies和Bivalent Fab-Fab抗體與腫瘤抗原A和CD3結(jié)合良好，說明這兩類重組雙特異性抗體構(gòu)建正確。雖然CrossMAbs類型抗體也會結(jié)合，但它們的結(jié)合很可能是由半合成狀態(tài)的抗體造成的。

項目的順利推動，其中包含2000多封郵件溝通，30多個技術(shù)人員辛勤實驗，歷時4年，中法科學(xué)家通力合作。

目前，其中一個雙特異性抗體已經(jīng)完成開發(fā)，生產(chǎn)并交付客戶1.237g抗體。接下來，客戶計劃采用我們擁有自主知識產(chǎn)權(quán)的細(xì)胞株進(jìn)行穩(wěn)定細(xì)胞株構(gòu)建，后續(xù)事宜正在商定中。

---

所有的抗體藥研發(fā)，都需要一個經(jīng)得起折騰的平臺。你需要的平臺是這樣的：

普健生物抗體藥物研發(fā)平臺，擁有經(jīng)驗豐富的抗體藥物研發(fā)團(tuán)隊，首席科學(xué)家成功上市過治療性抗體藥物，成熟的抗體設(shè)計、表達(dá)、純化技術(shù)，多元化的技術(shù)平臺，為國內(nèi)外科研院所及制藥企業(yè)提供抗體藥物研發(fā)服務(wù)。

以雜交瘤測序為基礎(chǔ)，經(jīng)嵌合抗體表達(dá)驗證到抗體的人源化設(shè)計改造，最終實現(xiàn)改造抗體的穩(wěn)定細(xì)胞株構(gòu)建和大規(guī)?？贵w制備一站式服務(wù)。噬菌體平臺技術(shù)，可為廣大科研和企業(yè)用戶提供抗原表位篩選、藥物靶點篩選、多種類型的抗體文庫構(gòu)建服務(wù)，為抗體藥前期挖掘提供了方向。