隨著生物技術(shù)的迅猛發(fā)展,全球化資源整合為生物制藥行業(yè)提供了越來越全面的技術(shù)支撐,抗體藥物的發(fā)展也獲得越來越多的重視。抗體藥物開發(fā)是一個非常繁雜的過程,而穩(wěn)定細(xì)胞株適用于抗體藥開發(fā)的各個階段,如重組蛋白和抗體生產(chǎn)、檢測分析、功能性研究等等。構(gòu)建適用于工業(yè)生產(chǎn)的高表達(dá)細(xì)胞株是第一步也是關(guān)鍵步驟之一。

普健生物在重組蛋白表達(dá)、抗體生產(chǎn)及穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株構(gòu)建等方面有著10余年經(jīng)驗。今天小普與大家分享一種基于CHO細(xì)胞株構(gòu)建的高效抗體藥開發(fā)策略,能顯著提高細(xì)胞株開發(fā)效率,實現(xiàn)高效、穩(wěn)定的細(xì)胞株開發(fā)。

哺乳動物細(xì)胞是用于生產(chǎn)單抗在內(nèi)的商業(yè)化治療性蛋白產(chǎn)品的主要宿主細(xì)胞。中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞是生產(chǎn)蛋白類藥物的首選宿主細(xì)胞,因為與其他系統(tǒng)相比,CHO細(xì)胞具有以下優(yōu)點：

①CHO 細(xì)胞對蛋白有準(zhǔn)確的加工、修飾功能,因此其表達(dá)的蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性更接近于天然蛋白；

②CHO 細(xì)胞耐受剪切力和滲透壓的能力相對較強,可根據(jù)培養(yǎng)要求選擇貼壁培養(yǎng)或懸浮培養(yǎng)的方式；

③整合外源基因后的細(xì)胞穩(wěn)定,重組基因能高效擴增和表達(dá)；

④表達(dá)目的蛋白可由細(xì)胞內(nèi)運輸?shù)郊?xì)胞外,并且CHO 細(xì)胞只表達(dá)少量的內(nèi)源蛋白,有利于目的蛋白的提取。

哺乳動物細(xì)胞的培養(yǎng)生長過程需要谷氨酰胺（L-glutamine），谷氨酰胺合成酶（GS)將谷氨酸和氨轉(zhuǎn)化為谷氨酰胺，哺乳動物細(xì)胞通過這一酶促反應(yīng)獲得谷氨酰胺。

CHO細(xì)胞內(nèi)源的谷氨酰胺合成酶活性比較低,需要在培養(yǎng)基中額外添加外源谷氨酰胺才能促進(jìn)細(xì)胞生長。利用GS抑制劑,L-氨基亞砜蛋氨酸(Methionine Sulphoximine，MSX)抑制內(nèi)源性GS活性，用含目的基因和GS基因標(biāo)記的表達(dá)載體,轉(zhuǎn)染宿主CHO細(xì)胞,通過MSX加壓篩選，促使GS基因和目的蛋白基因擴增,只有轉(zhuǎn)染了額外GS基因的細(xì)胞才可以在不含有谷氨酰胺（L-glutamine）的培養(yǎng)基中生長,從而篩選獲得重組表達(dá)細(xì)胞株。

工業(yè)上主要使用兩大類CHO細(xì)胞：

①GS野生型,含弱的GS活性(GS WT):CHO-K1(ATCC CCL-61,ECACC 85051005)，CHOK1SV(lonza);

②GS缺陷型,敲除GS活性(GS KO):CHOK1SV-KO(Lonza),CHOZN(Merk),HD-BIOP3(Horizon)。

細(xì)胞轉(zhuǎn)染是將外源分子(如DNA,RNA)導(dǎo)入真核細(xì)胞，細(xì)胞株篩選方案包括一系列步驟：

構(gòu)建生產(chǎn)重組抗體的CHO穩(wěn)定細(xì)胞株。

Fig.1 單克隆產(chǎn)量分析

Fig.2 流加表達(dá)測試產(chǎn)量優(yōu)化

Fig.3 抗體聚體分析（SEC-HPLC）

Fig.4 抗體親和力分析（Biacore）

Fig.5 細(xì)胞株穩(wěn)定性分析圖

XtenCHO^TM高密度表達(dá)系統(tǒng)的轉(zhuǎn)染試劑、表達(dá)培養(yǎng)基和補料培養(yǎng)基相較于常用的陽離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑、商業(yè)化CHO培養(yǎng)基以及補料培養(yǎng)基,成本大大降低,更適用于工業(yè)生產(chǎn),在規(guī)模較大的重組蛋白瞬時表達(dá)生產(chǎn)中更能體現(xiàn)其性價比高的特點。

普健生物擁有高效的CHO穩(wěn)定細(xì)胞株構(gòu)建體系，從上游的雜交瘤抗體測序，到序列優(yōu)化，人源化，再到細(xì)胞株構(gòu)建，個性化細(xì)胞株優(yōu)化及質(zhì)控檢測，整個技術(shù)體系成熟，儀器配備齊全，能夠快速助力抗體藥的臨床前研究。普健生物憑借十余年的抗體藥物研發(fā)項目經(jīng)驗，自主開發(fā)了CHO-GS KO細(xì)胞系及GS載體系統(tǒng)，抗體表達(dá)產(chǎn)量>3g/L以上。自主研發(fā)了CHO細(xì)胞專利轉(zhuǎn)染技術(shù)，及提高抗體產(chǎn)量的穩(wěn)定細(xì)胞株篩選技術(shù)。擁有完善的抗體質(zhì)量分析平臺，可以提供ELISA、FACS、還原/非還原SDS-PAGE、SDS-CE、SEC-HPLC、LC-MS、ADCC和Biacore等分析。