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細胞轉染,簡而言之，就是將外源分子（如DNA,RNA等）導入真核細胞中的一種技術。

分類：

瞬時轉染（transient gene expression, TGE）和穩(wěn)定轉染(stable gene expression，SGE)兩種。

瞬時轉染

指外源 DNA或RNA 轉入宿主細胞后不整合到宿主染色體中進行外源目的基因的表達。

特點：

1.目的基因未整合到染色體上，超螺旋質粒DNA有較高的轉染效率；

2.轉染24h-72h后常需要用到一些報告系統(tǒng)如熒光蛋白、β半乳糖苷酶等來幫助檢測；

3.表達持續(xù)時間48-72h,隨細胞分裂而稀釋直至丟失；

4.用于快速分析:如基因產(chǎn)物短期表達、蛋白質小規(guī)模表達純化。

穩(wěn)定轉染

指外源DNA轉入宿主細胞后將外源目的基因整合到宿主染色體中進行表達。

特點：

1.目的基因整合到染色體上，需要使用線性DNA（線性DNA雖然比超螺旋狀的DNA轉入量低，但整合率高）；

2.外源DNA整合到宿主細胞染色體中大約為1%，通常需要通過一些選擇性標記反復篩選，才能得到穩(wěn)定轉染的同源細胞系。

3.隨宿主細胞基因組復制、轉錄、翻譯，并被穩(wěn)定遺傳；

4.用于獲得穩(wěn)定表達的外源基因的單細胞克?。喝绱笠?guī)模蛋白質的合成，長期的藥理學研究遺傳機制的研究等。

圖1 細胞轉染流程圖

細胞轉染的方法

物理法：電穿孔法、顯微注射法和基因槍法；

化學法：磷酸鈣共沉淀法、脂質體轉染方法、多種陽離子物質介導；

生物法：病毒介導轉染、逆轉錄病毒、腺病毒。

一些轉染方法方法的比較

轉染方法	原理	應用	特點
電穿孔法	高脈沖電壓破壞細胞膜點位，DNA通過膜上形成的小孔導入	瞬時轉染所有細胞	胞用量大，需要根據(jù)不同細胞類型優(yōu)化電穿孔實驗條件
顯微注射法	用顯微操作將DNA直接注入靶細胞核	穩(wěn)定轉染瞬時轉染	轉染細胞數(shù)有限，多用于工程改造或轉基因動物的胚胎細胞
基因槍法	將DNA用顯微重金屬顆粒沉淀，再將包被好的顆粒用彈道裝置射入細胞，DNA在胞內逐步釋放表達	瞬時轉染穩(wěn)定轉染	用于人的表皮細胞，纖維原細胞，淋巴細胞及原代細胞
磷酸鈣法	磷酸鈣DNA復合物吸附細胞膜被細胞內吞	穩(wěn)定轉染瞬時轉染	不適用于原代細胞，操作簡便但重復性差，有些細胞不適用
陽離子脂質體法	帶正電的脂質體與核酸帶負電的磷酸基團形成復合物被細胞內吞	穩(wěn)定轉染瞬時轉染所有細胞	實用性廣，轉染效率高，重復性好，但轉染時需要除血清。轉染效果隨細胞類型變化大
病毒介導法	通過侵染宿主細胞將外源基因整合到染色體中	穩(wěn)定轉染	可用于難轉染的細胞、原代細胞，體內細胞等
逆轉錄病毒	通過病毒中膜糖蛋白和宿主細胞表面的受體相互作用而進入宿主細胞，之后反轉入酶啟動合成DNA并隨機整合到宿主基因組中。	特定宿細胞	攜帶基因不能太大，細胞需要處于分裂期，需考慮安全因素
腺病毒	通過侵染宿主細胞將外源基因整合到染色體中	瞬時轉染特定宿主細胞	可用于難轉染的細胞，需要考慮安全因素

圖2 細胞轉染的一些常見方法

普健穩(wěn)定細胞株的構建

穩(wěn)定細胞株：一般是將外源DNA克隆到具有某種抗性或者選擇基因的載體上，載體被轉染到宿主細胞并整合到染色體中，用載體中所含的選擇標志進行篩選，篩選得到可穩(wěn)定表達目的蛋白的細胞株。

服務內容

1. 基因過表達、突變、沉默等科研用穩(wěn)轉細胞株構建；

2. 重組抗體，細胞因子等生物藥的穩(wěn)轉細胞系前期篩選。

技術流程及周期

1. 重組表達質粒構建（1周）

2. 藥物本底濃度測定（2周，可與1同時進行）

3. 細胞轉染（1天）

4. 多克隆穩(wěn)定細胞株篩選及鑒定（2-3周）

5. 單克隆穩(wěn)定細胞株篩選及鑒定（3-4周）

6. 穩(wěn)轉細胞株產(chǎn)量、活性檢測及穩(wěn)定性研究（根據(jù)客戶需求）

圖3 技術流程圖

服務優(yōu)勢

高質：外源基因嚴格鑒定，細胞來源清晰，無污染

高產(chǎn)：重組蛋白/抗體表達量可快速優(yōu)化至2g/L以上穩(wěn)定表達

穩(wěn)定：獨有的GS穩(wěn)轉系列載體配合MSX藥物篩選，實現(xiàn)穩(wěn)定傳代15代以上

快速：篩選高產(chǎn)細胞株，周期短至3個月

靈活定制：可針對重組蛋白/抗體全長或片段進行個性化表達

經(jīng)驗豐富：專業(yè)的技術團隊，已成功為國內外多家醫(yī)藥公司和研究單位構建交付穩(wěn)定細胞株

多篩選系統(tǒng)：G418/潮霉素/嘌呤霉素篩選系統(tǒng)，GS/DHFR 篩選孵化系統(tǒng)等

案例

穩(wěn)轉優(yōu)化前表達量28mg/L；穩(wěn)轉優(yōu)化后表達量2.3 g/L

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細胞轉染之穩(wěn)定細胞株的構建