蛋白定量

蛋白定量即蛋白質(zhì)定量，蛋白質(zhì)定量根據(jù)其目的分為蛋白質(zhì)的“總定量”和特定蛋白質(zhì)的“個(gè)別定量”。蛋白定量是生物學(xué)實(shí)驗(yàn)不可缺少的一部分，為驗(yàn)證細(xì)胞裂解是否成功，或?yàn)榱藢⒍鄠€(gè)樣品進(jìn)行平行實(shí)驗(yàn)比較或標(biāo)準(zhǔn)化保存，需對(duì)細(xì)胞裂解液進(jìn)行蛋白定量；為了判定蛋白的產(chǎn)量，需對(duì)純化好的蛋白進(jìn)行定量；為了將純化好的蛋白用生物素或報(bào)告酶進(jìn)行標(biāo)記，同樣需要首先對(duì)蛋白樣品進(jìn)行定量，以保證標(biāo)記反應(yīng)在適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)濃度下進(jìn)行。

 

蛋白質(zhì)是一種十分重要的生物大分子，它種類繁多，結(jié)構(gòu)不一，功能各異，分子量相差很大，因此建立一個(gè)理想而又通用的蛋白質(zhì)定量分析方法很因難。

現(xiàn)測(cè)定蛋白質(zhì)含量的方法有很多：根據(jù)物理性質(zhì)來分有紫外分光光度法；根據(jù)化學(xué)性質(zhì)來分有凱氏定氮法、雙縮脲法、Folin-酚試劑法（Lowary法）、BCA法和膠體金法；根據(jù)染色性質(zhì)有考馬斯亮藍(lán)染色法、銀染法；根據(jù)其他性質(zhì)有熒光法；其中較為常見的有以下五種。

 

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紫外分光光度法

 

蛋白質(zhì)分子中含有共軛雙鍵的酪氨酸、色氨酸等芳香族氨基酸具有吸收紫外光的性質(zhì)，其吸收高峰在280 nm波長(zhǎng)處，且在此波長(zhǎng)內(nèi)吸收峰的光密度值與蛋白濃度成正比，故可作為蛋白質(zhì)定量測(cè)定的依據(jù)。該方法是最快的蛋白質(zhì)定量方法，但由于各種蛋白質(zhì)中酪氨酸和色氨酸含量不同，如要準(zhǔn)確定量則應(yīng)有待測(cè)蛋白質(zhì)的純品作為標(biāo)準(zhǔn)來比較，或者知道其消光系數(shù)作為參考。另外，不少雜質(zhì)在280 nm波長(zhǎng)下也有—定吸收能力，可能發(fā)生干擾，其中核酸(嘌呤和嘧啶)的影響尤為嚴(yán)重。核酸的最大吸收峰是在260 nm，因此若溶液中存在核酸，必須同時(shí)測(cè)定OD₂₆₀與OD_280，然后根據(jù)兩種波長(zhǎng)的吸收度比值，通過經(jīng)驗(yàn)公式校正，以消除核酸的影響而推算出蛋白質(zhì)的真實(shí)含量。 

優(yōu)點(diǎn)

操作簡(jiǎn)便迅速，且不消耗樣品(可以回收)，多用于純化蛋白質(zhì)的微量測(cè)定。

缺點(diǎn)

（1）當(dāng)待測(cè)的蛋白質(zhì)與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)中的酪氨酸和色氨酸含量差異較大時(shí)，會(huì)產(chǎn)生—定誤差。

（2）混有核酸時(shí)必須分別測(cè)定280 nm和260 nm兩處的OD值，再按公式推算蛋白質(zhì)含量。

 

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雙縮脲法

 

雙縮脲（NH₃CONHCONH₃）是兩個(gè)分子脲經(jīng)180℃左右加熱放出一個(gè)分子氨后得到的產(chǎn)物。在強(qiáng)堿性溶液中，雙縮脲與CuSO₄形成紫色絡(luò)合物，稱為雙縮脲反應(yīng)。凡具有兩個(gè)酰胺基或兩個(gè)直接連接的肽鍵，或能通過一個(gè)中間碳原子相連的肽鍵，這類化合物都有雙縮脲反應(yīng)。紫色絡(luò)合物顏色的深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比，而與蛋白質(zhì)分子量及氨基酸成分無關(guān)，故可用來測(cè)定蛋白質(zhì)含量。測(cè)定范圍為1-10 mg蛋白質(zhì)。干擾這一測(cè)定的物質(zhì)主要有硫酸銨、Tris緩沖液和某些氨基酸等。

優(yōu)點(diǎn)

較快速 ，不同的蛋白質(zhì)產(chǎn)生顏色的深淺相近，以及干擾物質(zhì)少。

缺點(diǎn)

靈敏度差，常用于需要快速但并不需要十分精確的蛋白質(zhì)測(cè)定。

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考馬斯（Comessie)亮蘭結(jié)合法

 

考馬斯亮蘭結(jié)合法是近年來發(fā)展起來的蛋白質(zhì)定量測(cè)定法?？捡R斯亮蘭能與蛋白質(zhì)的疏水區(qū)相結(jié)合，這種結(jié)合具有高敏感性，考馬斯亮蘭G250 的最大光吸收峰在465 nm，當(dāng)它與蛋白質(zhì)結(jié)合形成復(fù)合物時(shí)，其最大吸收峰變?yōu)?95 nm。在一定范圍內(nèi)，考馬斯亮蘭G250-蛋白質(zhì)復(fù)合物呈青色。在595 nm下，光密度與蛋白質(zhì)含量呈線性關(guān)系。故可以用于蛋白質(zhì)含量的測(cè)定。

優(yōu)點(diǎn)

（1）操作簡(jiǎn)便、快速；檢測(cè)靈敏；重復(fù)性好。 

（2）顯色迅速，約2分鐘內(nèi)可完成染料與蛋白質(zhì)的結(jié)合，所現(xiàn)顏色至少在1小時(shí)內(nèi)是穩(wěn)定的。 

（3）與改良Lowary法相比，干擾物質(zhì)較少。 

缺點(diǎn)

（1）當(dāng)樣品中存在較大量的SDS、TritonX-100等去垢劑時(shí)，顯色反應(yīng)會(huì)受到干擾。如樣品緩沖液呈強(qiáng)堿性時(shí)也會(huì)影響顯色，故必須預(yù)先處理樣品。 

（2）考馬斯亮蘭G250染液不宜久存，以1-2月為宜。 

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Lowary蛋白定量法

 

 

Lowary法是雙縮脲法和福林酚法的結(jié)合與發(fā)展，其原理是：蛋白質(zhì)溶液用堿性銅溶液處理，形成銅-蛋白質(zhì)的絡(luò)合鹽，在加入酚試劑后，除使肽鏈中酪氨酸、色氨酸和半胱氨酸等顯色外，還使雙縮脲法中肽鍵、堿性銅的顯色效果更強(qiáng)烈。因此，Lowary法的顯色效果比單獨(dú)使用酚試劑強(qiáng)烈3-15倍，為雙縮脲法的100倍。由于肽鍵顯色效果增強(qiáng)，從而減小了因蛋白質(zhì)種類引起的偏差。 

注意事項(xiàng)

（1）酚試劑只在酸性條件穩(wěn)定，故當(dāng)其加到堿性的銅-蛋白質(zhì)溶液中時(shí)，必須立即混勻，以便在磷鉬酸-磷鎢酸試劑被破壞前，還原反應(yīng)即能發(fā)生。 

（2）為了保證反應(yīng)進(jìn)行完全，反應(yīng)在25～30℃水浴中進(jìn)行，反應(yīng)30 min后準(zhǔn)時(shí)比色。 

（3）避免還原物質(zhì)干擾本實(shí)驗(yàn)。 

優(yōu)點(diǎn)

微克級(jí)高靈敏度定量測(cè)定，穩(wěn)定。

缺點(diǎn)

（1）受植物體內(nèi)存在的酚類物質(zhì)干擾。

（2）去污劑如TritonX-100，SDS，NP-40的濃度超過0.2%時(shí)會(huì)影響定量結(jié)果。

 

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BCA法

BCA( Bicinchoninic acid)法是近來廣為應(yīng)用的蛋白定量方法。其原理與Lowary法蛋白定量相似，即在堿性環(huán)境下蛋白質(zhì)與Cu²⁺絡(luò)合并將Cu²⁺還原成Cu¹⁺。BCA與Cu¹⁺結(jié)合形成穩(wěn)定的紫藍(lán)色復(fù)合物，在562 nm處有高的光吸收值并與蛋白質(zhì)濃度成正比，據(jù)此可測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。

BCA蛋白定量法需要兩種試劑：

試劑A：稱取1 g sodium bicinchoninate，2 g Na₂CO₃，0.16 g酒石酸鈉，0.4 g NaOH和0.95 g NaHCO₃，定容到100 ml，用NaOH將pH調(diào)到11.25。

試劑B：將0.4 g CuSO₄•5H₂O溶于10 ml水中。

工作液：100份試劑A和2份試劑B混合。

測(cè)量方法：取25 μl 標(biāo)準(zhǔn)品加入到200 μl BCA工作液中，37℃或60 ℃孵育30 min，檢測(cè)562 nm處的吸光度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。用同樣的方法檢測(cè)蛋白樣品的吸光度可算出蛋白樣品的濃度。

 

優(yōu)點(diǎn)

（1）靈敏度高，檢測(cè)濃度下限達(dá)到25 μg/ml，最小檢測(cè)蛋白量達(dá)到0.5 μg，待測(cè)樣品體積為1-20 μl。

（2）操作簡(jiǎn)單，快速，45分鐘內(nèi)完成測(cè)定，比經(jīng)典的Lowary法快4倍且更加方便。

（3）測(cè)定蛋白濃度不受絕大部分樣品中的去污劑等化學(xué)物質(zhì)的影響，可以兼容樣品中高達(dá)5%的SDS，5%的Triton X-100，5%的Tween 20，60，80。

（4）在20-200 μg/ml濃度范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系。

（5）檢測(cè)不同蛋白質(zhì)分子的變異系數(shù)遠(yuǎn)小于考馬斯亮藍(lán)蛋白定量法。

（6）經(jīng)濟(jì)實(shí)用，除試管外，測(cè)定可在微板孔中進(jìn)行，大大節(jié)約樣品和試劑用量。

缺點(diǎn)

受螯合劑和略高濃度的還原劑（EDTA小于10 mM，DTT小于1 mM，巰基乙醇低于1mM）的影響。

 

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以上是針對(duì)全蛋白質(zhì)的“總定量法”，然而許多實(shí)驗(yàn)需要對(duì)溶液中特定蛋白進(jìn)行定量分析，即針對(duì)特定蛋白質(zhì)的“個(gè)別定量”。針對(duì)特定蛋白定量常用的方法有酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法（ELISA），免疫印跡分析法（WB）和質(zhì)譜檢測(cè)（MS）。

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ELISA

 

 

ELISA是溶液中特定蛋白定量的一種常用方法，通常是在96孔板上進(jìn)行，關(guān)鍵步驟是特定抗原/蛋白的固定。具體來說，ELISA有不同變種。

直接或間接ELISA

特定抗原/蛋白直接吸附到檢測(cè)板，封閉未被抗原包被的孔板表面，然后在孔板中加入酶標(biāo)（直接ELISA）或未酶標(biāo)（間接ELISA）的第一抗體，在測(cè)試孔板中，一抗與抗原/蛋白相結(jié)合。對(duì)于未酶標(biāo)的第一抗體，加入酶標(biāo)的第二抗體與第一抗體結(jié)合。最后，加入酶底物（通常是四甲基聯(lián)苯胺TMB或堿性磷酸酶ALP）使溶液發(fā)生顏色變化然后使用分光光度計(jì)檢測(cè)。顏色變化與蛋白質(zhì)濃度是直接相關(guān)的。

直接ELISA的優(yōu)點(diǎn)是速度快，并且沒有第二抗體的交叉反應(yīng)問題，但局限是第一抗體的標(biāo)記可能是費(fèi)時(shí)和昂貴的。此外，信號(hào)放大是最弱的。因此，更常用的是

夾心ELISA

特定抗原/蛋白結(jié)合在孔板表面包被的第一抗體（捕獲抗體）和酶標(biāo)的第二抗體（檢測(cè)抗體）之間，第二抗體比較容易買到，但可能會(huì)發(fā)生第二抗體的交叉反應(yīng)。

任何ELISA測(cè)定蛋白質(zhì)濃度的一個(gè)重要環(huán)節(jié)都是蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線，通常是連續(xù)稀釋已知濃度的蛋白質(zhì)，從而繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

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WB

 

WB只能半定量。通過凝膠電泳把原始或變性的蛋白質(zhì)分開，把蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)膜（硝酸纖維素或PVDF），然后使用特定的酶標(biāo)抗體檢測(cè)。最后，加入適當(dāng)?shù)牡孜铮ɑ瘜W(xué)發(fā)光底物）產(chǎn)生可檢測(cè)的信號(hào)。雖然WB比ELISA更費(fèi)時(shí)，但是WB不僅可以對(duì)特定的蛋白進(jìn)行定量，而且可以在實(shí)驗(yàn)中同時(shí)檢測(cè)蛋白質(zhì)修飾。

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MS

 

MS是蛋白質(zhì)定量的新興方法。在蛋白質(zhì)組學(xué)分析中，除了蛋白定性之外，一個(gè)重要的步驟就是對(duì)特定的蛋白進(jìn)行定量分析。MS定量蛋白的方法有很多。

• 常用的方法是較重的穩(wěn)定同位素碳（¹³C）或氮（¹⁵N）加入到第一個(gè)樣本（多肽或蛋白質(zhì)），而相應(yīng)的輕同位素（¹²C和¹⁴N）加入到第二個(gè)樣本（內(nèi)標(biāo)），然后混合這兩個(gè)樣本進(jìn)行分析。由于兩個(gè)樣本的質(zhì)量差，用質(zhì)譜分析儀測(cè)定的兩個(gè)樣本峰強(qiáng)度的比值就相當(dāng)于其相對(duì)豐度比。

• 質(zhì)譜蛋白定量的第二種方法，可以不用標(biāo)記樣本，即用基質(zhì)輔助激光解吸/電離 - MALDI分析。

使用質(zhì)譜這種通用方法可以在一次實(shí)驗(yàn)中同時(shí)進(jìn)行定量和定性檢測(cè)。但這種方法需要的檢測(cè)儀器很昂貴，從而限制了該方法的使用。

 

總之，雖然測(cè)定蛋白質(zhì)含量的方法很多，但還沒有一個(gè)完美的方法。在選擇測(cè)定方法時(shí)，可根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求和實(shí)驗(yàn)室條件決定。