Selli等人發(fā)現(xiàn)，雖然攜帶CD28的嵌合抗原受體（CAR）T細(xì)胞通過(guò)腫瘤或慢性感染刺激下發(fā)生的經(jīng)典事件，從而發(fā)生功能障礙和耗竭，但攜帶4-1BB的CAR-T細(xì)胞則以由轉(zhuǎn)錄因子FOXO3驅(qū)動(dòng)的不同方式發(fā)生功能障礙。

十多年前，CAR-T細(xì)胞被證明對(duì)B細(xì)胞惡性腫瘤具有顯著的療效。它們均靶向B細(xì)胞分子CD19，并帶有CD28或4-1BB中1個(gè)共刺激分子的胞內(nèi)信號(hào)域。研究者假設(shè)將共刺激結(jié)構(gòu)域并入CAR可改善持久性和功能，從而改善抗腫瘤作用。由于這些初始產(chǎn)品取得顯著的初步成功，美國(guó)食品和藥物管理局批準(zhǔn)的所有6種構(gòu)建物，包括針對(duì)骨髓瘤漿細(xì)胞表達(dá)的b細(xì)胞成熟抗原的構(gòu)建物，以及臨床開(kāi)發(fā)中的大多數(shù)其他CAR，包括各種適應(yīng)癥，都包含這兩個(gè)信號(hào)域中的一個(gè)。

由于CAR以高親和力識(shí)別抗原，并且由組成型啟動(dòng)子表達(dá)，因此研究者早期注意到，抗原的持續(xù)刺激（有時(shí)甚至是CAR的高水平表達(dá)）可導(dǎo)致T細(xì)胞功能障礙。這些功能失調(diào)的T細(xì)胞在抗原刺激后的細(xì)胞毒性、細(xì)胞因子產(chǎn)生和增殖能力降低；這可以通過(guò)中斷信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的休息來(lái)克服。在患者中，高腫瘤負(fù)荷與應(yīng)答降低和T細(xì)胞功能障礙增加相關(guān)。到目前為止，這種功能障礙被認(rèn)為在本質(zhì)上與T細(xì)胞“耗竭”是相同的現(xiàn)象，而T細(xì)胞“耗竭”已經(jīng)在接受檢查點(diǎn)阻斷治療的慢性病毒感染和癌癥中得到了廣泛描述。

Selli等通過(guò)重復(fù)體外刺激攜帶CD28或4-1BB胞內(nèi)信號(hào)域的CD19導(dǎo)向的CAR T細(xì)胞來(lái)模擬慢性激活，從而產(chǎn)生功能障礙，然后對(duì)轉(zhuǎn)錄、表觀遺傳和表型程序進(jìn)行了全面分析。每48小時(shí)用低效靶比的新腫瘤細(xì)胞刺激CAR T細(xì)胞。2周后，CAR T細(xì)胞失去了殺傷抗原陽(yáng)性靶點(diǎn)的能力，不能再產(chǎn)生細(xì)胞因子，也不能再增殖。接下來(lái)，他們利用飛行時(shí)間的多參數(shù)細(xì)胞測(cè)定法從表型上研究了這些功能失調(diào)的CAR T細(xì)胞。研究發(fā)現(xiàn)，含有CD28的CAR - T細(xì)胞具有典型T細(xì)胞耗竭的特征，包括PD-1、TIGIT、LAG3、TIM3和CTLA4的重新表達(dá)（見(jiàn)圖）。相比之下，攜帶4-1BB CARs的功能失調(diào)T細(xì)胞占據(jù)不同的T分布隨機(jī)鄰居嵌入空間，其表面表達(dá)更高的CD62L和CD25。使用RNA測(cè)序檢查這些功能失調(diào)的CAR T細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄程序顯示，基于CD28的CAR T細(xì)胞高度富集與耗竭相關(guān)的基因，而基于4- 1BB的功能失調(diào)的CAR T細(xì)胞沒(méi)有典型的耗竭標(biāo)簽。
最近關(guān)于T細(xì)胞衰竭的研究強(qiáng)調(diào)，這種狀態(tài)是由特定的表觀遺傳改變決定的。研究人員還使用染色質(zhì)開(kāi)放性測(cè)序技術(shù)（ATAC-seq）證實(shí)了這些差異，特別是PD1編碼基因（PDCD1）的染色質(zhì)可及性測(cè)定法，在基于CD28的CAR T細(xì)胞中，這看起來(lái)像是典型的耗竭，但在基于4- 1BB的CAR T細(xì)胞中并非如此。研究人員隨后使用縱向單細(xì)胞RNA測(cè)序，確定大多數(shù)功能失調(diào)的4-1BB CAR T細(xì)胞是由一組涉及細(xì)胞毒性（GNLY、CCL5、PRF1、GZMA、GZMK、CTSW）、自然殺傷細(xì)胞特性（KLRK1、KLRC2）和T細(xì)胞分化（ID2）的獨(dú)特基因定義，他們將這些基因稱為TBBD標(biāo)簽。有趣的是，他們的TBBD標(biāo)簽在接受抗CD19 /4- 1BB CAR構(gòu)建物Tisagenlecleucel治療的1例患者中得到了證實(shí)，該患者雖然血液中有CAR T細(xì)胞，但淋巴瘤仍發(fā)生進(jìn)展。



攜帶不同共刺激結(jié)構(gòu)域的CAR-T細(xì)胞在慢性刺激后功能失調(diào)時(shí)表現(xiàn)出不同的轉(zhuǎn)錄、表觀遺傳和表型特征。攜帶4-1BB共刺激結(jié)構(gòu)域的CAR-T細(xì)胞重新激活FOXO3，其驅(qū)動(dòng)一種不同于經(jīng)典T細(xì)胞衰竭的新功能障礙程序。

為了了解這種功能障礙的新型分子程序的起源，研究團(tuán)隊(duì)研究了隨著時(shí)間的推移轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的可及性。正如預(yù)期的那樣，CD28-CAR功能障礙增加了Jun:Fos（AP1）結(jié)合的可及性，但相反，4-1BB-CAR功能障礙打開(kāi)了同源盒（HOX）和叉頭框（FOX）位點(diǎn)，并且小的條理性RNA測(cè)序數(shù)據(jù)顯示FOXO3活性高。此外，在機(jī)制研究中，通過(guò)CRISPR/Cas干擾FOXO3可使患者對(duì)重復(fù)抗原刺激后的功能障礙產(chǎn)生抵抗，相反，FOXO3過(guò)表達(dá)顯著減少了4-1BB（而非CD28） CAR T細(xì)胞在重復(fù)抗原刺激下的擴(kuò)增。在小鼠異種移植應(yīng)激模型中，注射極少量的CAR T細(xì)胞治療較高的腫瘤負(fù)荷，攜帶4-1BB胞內(nèi)信號(hào)域的FOXO3敲除CAR T細(xì)胞改善了生存。

值得注意的是，研究人員通過(guò)深度技術(shù)探究（從高維細(xì)胞測(cè)定到縱向單細(xì)胞RNA測(cè)序）發(fā)現(xiàn)了一種新的分子機(jī)制，同時(shí)仍然使用相對(duì)簡(jiǎn)單的體外模型（重復(fù)抗原刺激）。分子程序本身和FOXO3的重新激活是有趣的，可能在自然界中并不常見(jiàn)。在自然生物學(xué)中，4-1BB刺激與T細(xì)胞受體（TCR）刺激在時(shí)間上分離，而TCR表達(dá)本身隨著抗原暴露而循環(huán)，因此減少了緊張信號(hào)傳導(dǎo)的可能性。未來(lái)的研究可能包括在更多接受Tisagenlecleucel治療但無(wú)應(yīng)答的患者中進(jìn)一步驗(yàn)證TBBD轉(zhuǎn)錄特征和FOXO3活性。同樣，無(wú)論疾病狀態(tài)如何，我們都應(yīng)基于對(duì)新生CD19+ B細(xì)胞的長(zhǎng)期暴露，進(jìn)一步了解Tisagenlecleucel在患者中是否會(huì)耗竭。有趣的是，在接受治療的前2例患者（這2例患者均有長(zhǎng)期緩解）中，長(zhǎng)期暴露于新生B細(xì)胞被認(rèn)為在Tisagenlecleucel持續(xù)10年的過(guò)程中發(fā)揮了作用。此外，當(dāng)BCMA陽(yáng)性骨髓瘤患者在使用BCMA導(dǎo)向的CAR T細(xì)胞持續(xù)存在的情況下復(fù)發(fā)時(shí)，對(duì)于對(duì)其他抗原具有特異性的、攜帶4- 1BB的CAR T細(xì)胞（例如已批準(zhǔn)用于多發(fā)性骨髓瘤的兩種靶向B細(xì)胞成熟抗原[BCMA]的CAR T細(xì)胞）是否也表現(xiàn)出TBBD標(biāo)簽和FOXO3再激活，這將是該領(lǐng)域的興趣。最后，在機(jī)制水平，研究FOXO3敲除或C-Jun過(guò)表達(dá)在減少CAR-T細(xì)胞耗竭方面是否更有效將是有趣的。

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