單克隆抗體(monoclonal antibody,mAb)是一種通用的高度特異性結(jié)合蛋白，長期以來被認(rèn)為是對抗疾病的“魔彈”，也是臨床和科研等其他生物學(xué)用途的重要工具。然而這些應(yīng)用只有在實現(xiàn)離單個抗體的方法出現(xiàn)后才得以實現(xiàn)，雜交瘤技術(shù)就是這把將打開單抗應(yīng)用大門的“金鑰匙”。
雜交瘤技術(shù)是基于特定的B淋巴細胞與骨髓瘤細胞的融合，分離出針對給定抗原的單抗(MAbs)的常用技術(shù)。雜交瘤技術(shù)的出現(xiàn)徹底改變了傳統(tǒng)的醫(yī)學(xué)和研究領(lǐng)域，隨著1984年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎進一步認(rèn)可，雜交瘤技術(shù)越來越成熟的同時還不斷發(fā)展，隨之出現(xiàn)了噬菌體展示技術(shù)和單一B細胞抗體展示技術(shù)，越來越多的新技術(shù)應(yīng)用到這一領(lǐng)域，填補了雜交瘤策略的局限性。



雜交瘤細胞技術(shù)
由Georges Köhler和Cesar Milstein于1975年描述的雜交瘤技術(shù)是基于用所需抗原免疫動物，然后將特異性B淋巴細胞與“不朽”骨髓瘤細胞融合。產(chǎn)生的雜交細胞，稱為雜交瘤，然后被克隆以獲得穩(wěn)定的單克隆細胞系。在選擇感興趣的抗體分泌克隆后，將細胞轉(zhuǎn)移到大規(guī)模培養(yǎng)裝置中，以產(chǎn)生所需數(shù)量的抗體。
B淋巴細胞-骨髓瘤細胞融合通常通過使用化合物聚乙二醇(PEG)獲得。然而，這種藥物在一定程度上可能具有細胞毒性，并可能發(fā)生非特異性膜融合。另一種是通過珍珠鏈法，在電場和激光輻射的幫助下進行聚變。在這種情況下，用脈沖激光束照射接觸細胞表面，在細胞膜上形成一個小穿孔，這增加了促進細胞融合的機會。盡管珍珠鏈方法比PEG介導(dǎo)的策略有優(yōu)勢，但它仍然不能選擇性地控制特定B淋巴細胞與骨髓瘤細胞的融合。

雜交瘤技術(shù)一直處于單克隆抗體產(chǎn)生領(lǐng)域的前沿。目前，超過90%被批準(zhǔn)用于臨床用途的抗體是由該技術(shù)產(chǎn)生的，其中大多數(shù)是嵌合或人源化抗體。然而，基于雜交瘤的單克隆抗體產(chǎn)生的特點是篩選過程長，特異性單克隆抗體分泌細胞的次優(yōu)選擇，在早期階段很少可能進行單克隆抗體驗證，更不用說需要純化抗原靶點的可用性。為了優(yōu)化抗體生成，多年來已經(jīng)開發(fā)了該技術(shù)的幾種變體。

B細胞靶向(BCT)
B細胞靶向(BCT)方法，也稱為脈沖電場(PEF)，由Lo等人于1984年描述。它基于兩個中心點:識別感興趣抗原的B淋巴細胞的預(yù)選，以及使用直流電脈沖進一步將B淋巴細胞與骨髓瘤細胞融合。簡而言之，特定的生物素標(biāo)記抗原與相應(yīng)的B淋巴細胞結(jié)合，隨后通過鏈霉親和素恢復(fù)，產(chǎn)生B淋巴細胞-抗原-生物素-鏈霉親和素復(fù)合物。然后，將這種B淋巴細胞復(fù)合物與生物素標(biāo)記的骨髓瘤細胞共培養(yǎng)，并將所得到的混合物暴露于PEF以促進細胞融合。

最后一步，也是最關(guān)鍵的一步，其特點是靜電場暴露后細胞膜不穩(wěn)定，這使得細胞間融合的發(fā)生變得容易。

立體特異性靶向(SST)
構(gòu)象特異性單克隆抗體的早期描述發(fā)表于20世紀(jì)60年代，強調(diào)了這些抗體特異性識別特定化合物的一種立體異構(gòu)體的特征。已知立體特異性單克隆抗體對其配體具有高特異性，然而，這些單克隆抗體的產(chǎn)生在技術(shù)上具有挑戰(zhàn)性，特別是在高度結(jié)構(gòu)化和保存良好的靶標(biāo)的情況下。例如多跨膜蛋白的胞外環(huán)或結(jié)構(gòu)域，如膜結(jié)合受體。立體特異性靶向(Stereospecific Targeting, SST)方法就是為了解決這個問題而提出的，SST方法為B淋巴細胞-骨髓瘤細胞融合提供了50%以上的陽性，并且發(fā)現(xiàn)超過24%的生成克隆分泌所需的單克隆抗體。

噬菌體展示技術(shù)
1990年首次報道的噬菌體展示技術(shù)被認(rèn)為是生成單克隆抗體的有力工具。該方法基于George Smith在1985年描述的噬菌體展示概念，包括開發(fā)組合抗體噬菌體文庫——即大量展示抗體片段的噬菌體——以及隨后篩選識別目標(biāo)抗原的抗體。

噬菌體展示庫的構(gòu)建是該技術(shù)的重要組成部分。抗體庫的大小與找到特定抗體的概率成正比關(guān)系。下一代測序(NGS)是分析噬菌體展示文庫的變異性、序列組成和大小的重要工具。構(gòu)建噬菌體展示文庫比動物免疫后產(chǎn)生雜交瘤要昂貴得多。然而，噬菌體展示技術(shù)的抗體篩選步驟更快熟、價格更優(yōu)。

雖然噬菌體展示文庫是一種前景廣闊的抗體開發(fā)技術(shù)，但它也有局限性。噬菌體文庫的多樣性取決于細菌的轉(zhuǎn)化效率，并且僅限于噬菌體展示文庫中10¹⁰-10¹¹變體抗體的最大庫。

單B細胞技術(shù)
以上幾種產(chǎn)生單克隆抗體的技術(shù)平臺的一個固有特點是需要將B淋巴細胞與骨髓瘤細胞融合，長期以來，這是分離已知特異性的單一抗體的必要步驟。
在過去的幾十年里，技術(shù)的進步已經(jīng)允許從異質(zhì)原代細胞群中檢測和分離單一功能的B淋巴細胞，以及抗體基因的擴增和克隆，而無需使選定的抗體分泌細胞(ASC)永生化。這些單一B淋巴細胞方法，統(tǒng)稱為“單個B細胞技術(shù)”，顯示出快速生成中和單克隆抗體的吸引力和實用性。
單個B細胞技術(shù)以單個B細胞為起始點，利用每個B細胞只產(chǎn)生一種特異性抗體的特性，直接從單個B細胞中擴增出抗體基因，進而獲得抗原特異性抗體。該技術(shù)所制備的抗體具有高通量、高效率、高穩(wěn)定性、高特異性等優(yōu)點，保留了豐富的基因多樣性和輕重鏈可變區(qū)的天然配對，應(yīng)用前景廣泛，是最高效的抗體篩選方法之一。事實上，利用這種技術(shù)獲得了越來越多的針對病毒病原體感染的單克隆抗體，如HIV、登革熱、MERS-CoV和SARS-Cov-2。

普健生物依托自主研發(fā)的高通量活性蛋白表達系統(tǒng)，Single B細胞抗體發(fā)現(xiàn)技術(shù)平臺，噬菌體展示抗體庫技術(shù)和雜交瘤抗體開發(fā)平臺，抗體表達、抗體人源化和穩(wěn)定細胞株構(gòu)建平臺，擁有10余年的蛋白、抗體服務(wù)經(jīng)驗及專業(yè)的研發(fā)生產(chǎn)團隊，可提供全面的蛋白表達、抗體制備、抗體藥物發(fā)現(xiàn)、抗體人源化、重組抗體表達等一站式抗體發(fā)現(xiàn)技術(shù)服務(wù)，助力IVD檢測、疫苗生產(chǎn)、重組抗體開發(fā)。

自20世紀(jì)80年代中期以來，從雜交瘤技術(shù)的變化開始，到噬菌體展示技術(shù)，再到單B細胞技術(shù)的應(yīng)用，越來越多的單克隆藥物從理論設(shè)計到臨床科研到獲批上市，伴隨著人類后基因組學(xué)及代謝組學(xué)的發(fā)展，越來越多的單克隆抗體藥物種類將會幫助人們的獲得更多健康和發(fā)展。