隨著越來越多的重組抗體應(yīng)用于傳染性疾病中，人們對(duì)于此類抗體藥物越來越關(guān)注，尤其是針對(duì)目前尚無疫苗的高危人群和病原體的重組抗體。然而，表現(xiàn)為機(jī)會(huì)性或潛伏性感染的病原體表達(dá)復(fù)雜的毒力相關(guān)蛋白陣列，并擅長(zhǎng)躲避免疫應(yīng)答。一些病原體已經(jīng)發(fā)展出有選擇性地破壞抗體的策略，而另一些則制造誘餌表位，欺騙宿主免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抗體，這些抗體輕則沒有保護(hù)作用，重則推進(jìn)了發(fā)病機(jī)制。以重組抗體為代表的抗體工程策略可以通過訪問保守的中和表位、生成Fc結(jié)構(gòu)域來阻止捕獲或降解，甚至訪問隱藏在細(xì)胞內(nèi)的病原體，從而阻礙這些努力。病原體耐藥抗體的設(shè)計(jì)可以增強(qiáng)對(duì)這些復(fù)雜病原體的保護(hù)并指導(dǎo)疫苗免疫原的開發(fā)。設(shè)計(jì)針對(duì)特定病原體防御機(jī)制的重組抗體可以從三個(gè)方面著手：靶向屏蔽脆弱表位的病原體、靶向破壞抗體 FC 功能的病原體、靶向破壞宿主免疫力的病原體，今天我們主要介紹如何針對(duì)病原體保護(hù)脆弱的抗原表面進(jìn)行抗體的設(shè)計(jì)和重組。

針對(duì)病原體保護(hù)脆弱的抗原表位

抗體靶向的一個(gè)關(guān)鍵要求是易于識(shí)別病原體相關(guān)分子。最佳靶點(diǎn)由不同組織和感染的多個(gè)階段由大多數(shù)菌株表達(dá)表達(dá)，易于獲得，這些靶點(diǎn)要么在疾病進(jìn)展中發(fā)揮關(guān)鍵功能，要么募集調(diào)理素介導(dǎo)病原體破壞。這為病原體隱藏這些脆弱的表位提供了選擇壓力。對(duì)中和抗體和非中和抗體復(fù)合物中病毒糖蛋白的結(jié)構(gòu)-功能研究揭示了抗體逃逸的共同機(jī)制，包括抗原漂移、表位屏蔽和免疫向優(yōu)勢(shì)但非保護(hù)性表位的定向。這些見解結(jié)合新的表位特異性和靶點(diǎn)未知的抗體發(fā)現(xiàn)工具，支持設(shè)計(jì)更有彈性的藥物性抗體。

結(jié)合抵抗抗原漂移的保守表位的抗體

人們?cè)诖_定靶向包膜病毒(包括RSV、流感病毒、HIV和冠狀病毒)保守表位的抗體方面已經(jīng)投入了大量工作，從而開發(fā)出可預(yù)防多種毒株的廣譜反應(yīng)性抗體和疫苗。這些病毒利用融合糖蛋白入侵宿主細(xì)胞，首先附著在宿主細(xì)胞受體上，然后經(jīng)歷巨大的構(gòu)象變化將病毒和宿主的膜結(jié)合在一起并介導(dǎo)膜融合。確定中和抗體的努力集中在受體結(jié)合域，以阻斷這種初始相互作用。

事實(shí)上，這些區(qū)域具有高度的免疫原性，結(jié)合關(guān)鍵表位的抗體可有效中和。對(duì)RSV F融合蛋白進(jìn)行的重要研究表明，融合前構(gòu)象比融合后構(gòu)象包含更多的中和表位，并且這些表位可能在構(gòu)象變化過程中丟失?？贵wD25與融合前位點(diǎn)Ø結(jié)合，從而阻斷受體結(jié)合，中和RSV的效力比目前臨床使用的識(shí)別融合后表位的抗體(帕利珠單抗)高50倍。D25作為Nirsevimab正在通過臨床試驗(yàn)取得進(jìn)展，其半衰期Fc延長(zhǎng)，可以單次給藥。

鑒定這種強(qiáng)效抗體對(duì)于其他病毒來說一直具有挑戰(zhàn)性，部分原因是受體結(jié)合域的高度序列變異，這通常會(huì)限制抗體的中和作用僅局限于少數(shù)毒株。

在SARS-CoV-2中，多種抗體阻斷梭原刺突蛋白與ACE2受體獲得了緊急使用授權(quán)，但由于新變異株的突變而迅速失效。因此需要鑒定參與保守殘基的中和抗體，通常在隱秘的表位中，不易受到抗原漂移的影響。納米抗體在這種情況下特別有用，因?yàn)樗鼈兊男〕叽绾烷L(zhǎng)CDR3環(huán)可以進(jìn)入IgG抗體無法獲得的表位，因此不太容易受到人體免疫系統(tǒng)壓力引起的抗原漂移的影響。一項(xiàng)針對(duì)免疫駱駝的努力確定了數(shù)百個(gè)CDR3納米抗體家族，靶向穗峰。其中包括具有皮摩爾親和力的強(qiáng)效納米抗體，可在動(dòng)物模型中中和多種SARS-CoV-1和2毒株，而其高穩(wěn)定性支持經(jīng)鼻給藥，從而在感染部位達(dá)到治療濃度。為了誘導(dǎo)抗體與保守的中和第4類和1/4類表位結(jié)合，用含有來自8株菌株的受體結(jié)合域嵌合體的納米顆粒進(jìn)行免疫似乎有希望。這一領(lǐng)域的巨大努力凸顯了找到中和可變受體結(jié)合域的交叉反應(yīng)性抗體的挑戰(zhàn)和前景。

Figure 1  Key domains and antibody-targeted vulnerable sites in viral fusogen proteins from SARS-CoV-2, HIV-1, and influenza. For each virus, the overall interactions with the respective cellular receptor are shown along with the structure of each corresponding fusogen, indicating key domains and epitopes. Structures for influenza hemagglutinin H3 are from PDB 4FNK, for the HIV-1 envelope from PDB 5CJX, and for the SARS-CoV-2 spike from PDB 7SXT. Abbreviation: MPER, membrane-proximal external region. Adapted from images created with BioRender.

鑒定與罕見的、保守的中和表位結(jié)合的抗體的另一種方法是鑒定那些與功能受限的表位結(jié)合的抗體。在融合糖蛋白中，這包括發(fā)生構(gòu)象變化的高度保守區(qū)域，或稱為莖、柄或S2域。在一項(xiàng)感染研究中，在流感中，結(jié)合該區(qū)域的血清抗體與保護(hù)作用相關(guān)，而且這些抗體似乎不太容易被病毒逃逸大多數(shù)中和抗體結(jié)合的是血凝素受體結(jié)合頭結(jié)構(gòu)域內(nèi)的毒株特異性表位，而與融合柄結(jié)合的抗體可通過抑制低ph核內(nèi)體中膜融合所需的構(gòu)象重排和招募Fc效應(yīng)蛋白功能來中和多個(gè)病毒群(Figure 1)。Guthmiller等發(fā)現(xiàn)了一個(gè)高度保守的血凝素錨定表位，該表位在人類B記憶庫(kù)中常見。結(jié)合這一表位的抗體可穩(wěn)定病毒膜附近的血凝素，從而中和廣泛的H1毒株、潛在的大流行H2和H5毒株以及常見的A388V柄逃逸變異株。同樣，3A3抗體和7A3納米抗體均靶向高度保守的β冠狀病毒鉸鏈，從而結(jié)合廣泛的毒株，而且7A3已被證明保護(hù)表達(dá)ACE2的人小鼠免受Delta SARS-CoV-2感染。結(jié)合保守干性表位的抗體可以識(shí)別廣泛的毒株，但它們對(duì)保護(hù)作用的貢獻(xiàn)尚未完全清楚。

這些成功激發(fā)了人們對(duì)識(shí)別其他靶蛋白(包括復(fù)雜細(xì)菌病原體表達(dá)的蛋白)上高度保守的表位的興趣。結(jié)合細(xì)菌表面的保護(hù)性抗體可通過Fc受體直接介導(dǎo)吞噬作用或激活補(bǔ)體，導(dǎo)致C3b調(diào)理作用，繼而吞噬作用或直接溶解細(xì)菌。一個(gè)關(guān)鍵限制是抗原表面密度必須足夠高，以支持觸發(fā)這些事件所需的抗體和受體聚集。就腦膜炎奈瑟菌而言，每個(gè)細(xì)胞似乎都需要>757因子H蛋白。目標(biāo)蛋白也應(yīng)該是必需的，因?yàn)闅⒕贵w可導(dǎo)致抗原丟失，正如觀察到的蛋白百日咳黏著素(pertactin)一樣，許多百日咳鮑特菌疫苗中含有百日咳黏著素。為此，通過篩選人類供體細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)了與保守和保護(hù)性肺炎鏈球菌抗原肺炎鏈球菌組氨酸三聯(lián)體蛋白PhtD結(jié)合的抗體。這些蛋白與來自幾種血清型莢膜細(xì)菌的抗原結(jié)合，保護(hù)小鼠免受原發(fā)性和繼發(fā)性攻擊，為單獨(dú)靶向>100不同莢膜血清型提供了一種潛在的替代方案。同樣，萊姆病病原體伯氏疏螺旋體(Borrelia burgdorferi)外表面蛋白VlsE(表達(dá)的可變主要蛋白樣序列)的保守區(qū)域已被確定，但它們的治療潛力仍有待確定。這些報(bào)告令人興奮，因?yàn)樗鼈兲崾窘Y(jié)合細(xì)菌表面蛋白的抗體可用于補(bǔ)充結(jié)合細(xì)菌碳水化合物的抗體。

進(jìn)入隱藏表位的抗體

抗體可以接觸到溶劑暴露的表位，這對(duì)抗原漂移產(chǎn)生壓力，從而逃避抗體結(jié)合。因此，病原體可以遮蔽保守的和功能重要的表位。一種策略是提出高免疫原性但無保護(hù)性的誘騙表位，以限制抗體對(duì)鄰近易損表位的識(shí)別。

與這一高度保守的表位結(jié)合的抗體很罕見，因?yàn)樗徱粋€(gè)免疫顯性和高可變的環(huán)。從免疫原中刪除該環(huán)可誘導(dǎo)產(chǎn)生高水平IgG22樣抗體，從而保護(hù)小鼠免受不同β-人冠狀病毒的感染。類似地，人巨細(xì)胞病毒gB融合原在抗原結(jié)構(gòu)域2中包含一個(gè)高度保守的位點(diǎn)1(跨越第69 ~ 78位殘基)，該位點(diǎn)可誘導(dǎo)產(chǎn)生有效的保護(hù)性抗體。該位點(diǎn)被與相鄰位點(diǎn)2(跨越殘基50 ~ 54)和免疫顯性抗原域1結(jié)合的抗體有效掩蓋，這兩個(gè)位點(diǎn)都主要引起非中和抗體。根據(jù)IgG22報(bào)告推斷，未來的免疫原設(shè)計(jì)工作可能能夠?qū)⒚庖邞?yīng)答集中在gB位點(diǎn)1和其他抗原中的次優(yōu)勢(shì)但具有保護(hù)作用的表位。

第二種策略是使用糖基化位點(diǎn)來屏蔽脆弱的表位。HIV-1包膜被>25 n連接的糖基化位點(diǎn)修飾，這些糖基化位點(diǎn)保護(hù)了廣泛中和表位，包括V1V2位點(diǎn)，即gp120上的第一個(gè)和第二個(gè)可變區(qū)(圖1)。在RV144疫苗的Ⅲ期試驗(yàn)中，V1V2結(jié)合抗體介導(dǎo)Fc效應(yīng)功能(抗體依賴性細(xì)胞吞噬和補(bǔ)體激活)，而不是廣泛中和作用，從而與保護(hù)作用相關(guān)。該區(qū)域在許多供體中引起交叉反應(yīng)性抗體，但需要廣泛的體細(xì)胞超突變和長(zhǎng)CDRH3環(huán)才能訪問表位。與先前的結(jié)合V1V2的抗體PG9不同，CAP256-VR26抗體系結(jié)合V1V2區(qū)域，并在耐受刺突聚糖N160和N156丟失的情況下產(chǎn)生了有效的fc介導(dǎo)的保護(hù)作用。其他廣泛的HIV中和抗體需要多年的成熟和廣泛的體細(xì)胞超突變，與之不同，CAP256-VRC26.08包含的突變要少得多，這可以簡(jiǎn)化通過接種疫苗產(chǎn)生類似抗體的策略。

第三種策略是結(jié)構(gòu)阻斷易損表位。例如，受體結(jié)合表位可僅在需要與受體結(jié)合時(shí)短暫暴露。SARS-CoV-1/-2 交叉反應(yīng)抗體CR3022已報(bào)告了這一點(diǎn)，該抗體與一個(gè)隱表位結(jié)合，當(dāng)受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域處于下降狀態(tài)時(shí)隱藏，但當(dāng)該域轉(zhuǎn)變?yōu)樯蠣顟B(tài)并與ACE2受體結(jié)合時(shí)隱表位被暴露。同樣，廣中和抗HIV抗體3BNC117和10-1074僅在CD4與HIV-1包膜接合以暫時(shí)暴露脆弱的CD4結(jié)合位點(diǎn)。因此，只有在存在小分子CD4模擬物的情況下，接種HIV-1 gp120變異株的非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物對(duì)HIV-1感染T細(xì)胞的抗體依賴性細(xì)胞毒性(ADCC)改善。gp41包膜蛋白的膜近端外部區(qū)域引發(fā)最廣泛的中和單克隆抗體（例如4E10、LN01、VRC42），但這些很少見，因?yàn)樵摫砦粌H在融合前至融合后的轉(zhuǎn)化過程中短暫暴露。可能需要同時(shí)給藥兩種抗體才能接近某些表位:一種抗體可使靶蛋白穩(wěn)定在開放狀態(tài)(例如受體模擬物)，另一種抗體可與敏感表位結(jié)合。

靶向可變抗原的抗體

上述例子突顯了靶向僅需要少數(shù)蛋白質(zhì)就可感染細(xì)胞的病毒的易損表位所面臨的挑戰(zhàn)。將這些策略應(yīng)用于表達(dá)更多表面抗原的細(xì)菌病原體會(huì)帶來額外的挑戰(zhàn)，因?yàn)樵谠S多情況下，靶點(diǎn)的關(guān)鍵分子并不明顯。

鑒于細(xì)菌碳水化合物(脂多糖和莢膜多糖)的豐度、可及性和免疫原性，它們一直是主要靶點(diǎn)。事實(shí)上，使用腦膜炎奈瑟氏菌血清群A膠囊的糖綴合物接種疫苗幾乎消除了該血清群的臨床病例。遺憾的是，這些分子也具有高度的變異型:雖然銅綠假單胞菌脂多糖疫苗在動(dòng)物模型中可誘導(dǎo)保護(hù)性免疫，但存在20種以上 o抗原血清型，許多有多個(gè)亞型，因此有必要開發(fā)血清型特異性治療方法。

鑒于細(xì)菌碳水化合物的多樣性和產(chǎn)生針對(duì)這些柔性分子的抗體的挑戰(zhàn)，保守表面蛋白可能更適合作為抗體靶點(diǎn)。鑒定出一種與大腸桿菌必需外膜輸出蛋白BamA結(jié)合的抗體，該抗體與一個(gè)細(xì)胞外環(huán)結(jié)合，從而破壞BamA功能?？贵w結(jié)合誘導(dǎo)細(xì)菌應(yīng)激反應(yīng)，破壞外膜完整性，并在亞納摩爾濃度(49)下殺死細(xì)菌。然而，由于外膜蛋白隱藏在表面碳水化合物之下，因此該抗體僅對(duì)具有最小脂多糖結(jié)構(gòu)的菌株有效。

盡管已經(jīng)鑒定出成功的抗原，如腦膜炎奈瑟氏菌H因子(22)和肺炎鏈球菌PhtD蛋白，但這些報(bào)告凸顯了預(yù)先選擇合適的細(xì)菌靶點(diǎn)的挑戰(zhàn)。為了替代使用靶向未知方法分離抗體，DiGiandomenico等從感染患者和健康人中鑒定出與完整銅綠假單胞菌細(xì)胞結(jié)合的抗體，并對(duì)其進(jìn)行調(diào)理吞噬細(xì)胞殺傷篩選。一組單基因敲除的銅綠假單胞菌分離株表明，所有選擇的抗體均結(jié)合了表面暴露的多糖Psl，該多糖在多個(gè)菌株中保守，并在多種疾病狀態(tài)下表達(dá)?？筽s1鉛抗體Cam-003結(jié)合了173株銅綠假單胞菌臨床分離株中的85%，盡管親和力僅為144 nM，但在小鼠急性致死性肺炎模型中提供了強(qiáng)大的保護(hù)作用。

病原體的適應(yīng)性需要抗體靶向方法的創(chuàng)新。這可以包括使用來自多個(gè)毒株的抗原誘餌來識(shí)別針對(duì)已知靶點(diǎn)的交叉反應(yīng)性抗體的抗體發(fā)現(xiàn)策略，這種方法已經(jīng)識(shí)別了結(jié)合不同病毒表位的一系列抗體。為了將這些方法擴(kuò)展到更復(fù)雜的細(xì)菌病原體，靶向未知方法以及隨后對(duì)所需功能的廣泛篩查顯示出了希望。

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