免疫系統(tǒng)為入侵的病原體提供了關(guān)鍵的防御，面對(duì)對(duì)小分子藥物的耐藥性上升和新抗菌劑管道的萎縮，這些病原體變得越來(lái)越重要。保護(hù)性抗體是任何免疫反應(yīng)的關(guān)鍵組成部分，因?yàn)樗鼈兛梢灾泻头置诘亩舅?，阻斷與宿主細(xì)胞的相互作用，并招募免疫系統(tǒng)防御。這些抗體可以通過(guò)自然感染或疫苗接種引起，也可以作為純化的蛋白質(zhì)被動(dòng)給藥。

目前單克隆抗體藥物已用于五種傳染病:呼吸道合胞病毒(RSV)、炭疽、復(fù)發(fā)性艱難梭菌、SARS-CoV-2和埃博拉病毒。事實(shí)證明，開(kāi)發(fā)針對(duì)更復(fù)雜的病原體的有效疫苗和抗體藥物具有挑戰(zhàn)性，因?yàn)樽匀幻庖吡νǔ２蛔阋苑乐乖俑腥?。這些病原體編碼多種蛋白質(zhì)，其表達(dá)由復(fù)雜的調(diào)控途徑協(xié)調(diào)，在不同的疾病狀態(tài)下表達(dá)的抗原很少。功能冗余毒力因子和菌株變異的表達(dá)會(huì)使靶標(biāo)選擇進(jìn)一步復(fù)雜化。此外，許多病原體已經(jīng)進(jìn)化出多種免疫逃避策略，在某些情況下，可以在吞噬作用后避免消除。即使是基因相對(duì)較少的病原體，如流感和SARS-CoV-2病毒，也設(shè)法迅速逃避針對(duì)少數(shù)靶向蛋白質(zhì)的免疫反應(yīng)，這強(qiáng)調(diào)了對(duì)更復(fù)雜的抗體的需求。因此，在上篇介紹針對(duì)病原體保護(hù)脆弱的抗原表位進(jìn)行重組抗體的設(shè)計(jì)和開(kāi)發(fā)策略之后，我們今天總結(jié)下靶向破壞抗體Fc功能的病原體進(jìn)行重組抗體的設(shè)計(jì)和開(kāi)發(fā)策略。

盡管有許多努力集中在開(kāi)發(fā)中和或封閉抗體，但Fc效應(yīng)功能在保護(hù)作用中的作用越來(lái)越得到認(rèn)識(shí)。這些可由人IgG1和IgG3同種型介導(dǎo)，后者與宿主Fc受體結(jié)合，通過(guò)自然殺傷(NK)細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的抗體依賴性細(xì)胞吞噬作用以及補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性介導(dǎo)ADCC。這些反應(yīng)依賴于Fc與補(bǔ)體成分C1q和經(jīng)典激活性Fc受體CD16A和CD32A的相互作用，而這兩種受體高度依賴于靶細(xì)胞表面的抗原密度和表位可及性。雖然Fc相互作用可導(dǎo)致抗體依賴的增強(qiáng)型疾病，尤其是在登革熱感染中，但它們通常代表了適應(yīng)性免疫應(yīng)答的強(qiáng)大力量，可以補(bǔ)充中和抗體。不幸的是，這也為病原體提供了選擇壓力，使其通過(guò)降解或隔離抗體來(lái)逃避這些功能。針對(duì)抗裂解、阻斷蛋白酶活性或抗抗體隔離而設(shè)計(jì)的抗體為消除這些免疫逃逸策略提供了機(jī)會(huì)。

抗致病性蛋白酶活性的抗體
木瓜蛋白酶和胃蛋白酶等酶通常通過(guò)分別在上鉸鏈區(qū)和下鉸鏈區(qū)切割序列來(lái)產(chǎn)生Fab和F(ab ')2抗體片段。幾種與腫瘤侵襲和炎癥相關(guān)的人基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)，如MMP-3和MMP-7，也可以切割免疫球蛋白，這表明這些特征在系統(tǒng)發(fā)育過(guò)程中是常見(jiàn)的。作為免疫逃逸的一部分，細(xì)菌可以分泌具有同源功能的酶。例如，鏈球菌熱原性外毒素B (SpeB)、免疫球蛋白g降解酶(IdeS)和內(nèi)糖苷酶(enos)是由化膿性鏈球菌和裂解抗體分泌。SpeB對(duì)免疫球蛋白有廣泛的特異性，ide對(duì)IgG鉸鏈有特異性，而EndoS會(huì)去除與Fc受體結(jié)合所需的N297殘基上的糖。類(lèi)似地，金黃色葡萄球菌產(chǎn)生谷氨酰內(nèi)肽酶V8 (GluV8)，該酶在上鉸鏈區(qū)切割免疫球蛋白，而銅綠假單胞菌分泌大量的彈性蛋白酶B (LasB)，該酶也可能在鉸鏈區(qū)切割免疫球蛋白。

雖然生物技術(shù)的應(yīng)用是有效的，但抗體裂解可能不利于保護(hù)性免疫反應(yīng)。事實(shí)上，添加蛋白酶抑制劑降低了抗體切割，同時(shí)增加了C3b補(bǔ)體沉積和中性粒細(xì)胞對(duì)金黃色葡萄球菌的吞噬。大多數(shù)IGg特異性蛋白酶采用兩步過(guò)程:一個(gè)重鏈鉸鏈被裂解，產(chǎn)生一個(gè)中間產(chǎn)物，然后第二個(gè)鉸鏈被緩慢裂解，產(chǎn)生Fc和Fab或F(ab ')2片段。單獨(dú)切割的IgG保留抗原結(jié)合活性，但不再促進(jìn)效應(yīng)功能。在許多個(gè)體中觀察到與裂解的IgG1結(jié)合的自身抗體，這表明這一中間產(chǎn)物具有免疫原性和生理學(xué)意義。裂解抗體在細(xì)菌表面的累積會(huì)抑制完整抗體與抗原的接觸，從而減少Fc效應(yīng)功能的募集。因此，即使是不完全的抗體裂解也能有效地逃避免疫反應(yīng)。

為了恢復(fù)因抗原結(jié)合抗體和裂解抗體而喪失的Fc效應(yīng)細(xì)胞功能，研究者探索了使用可識(shí)別裂解產(chǎn)生的新表位的抗體(Figure 2)。這些完整的抗體可以重建靶細(xì)胞和吞噬細(xì)胞上Fc受體之間中斷的聯(lián)系。Jordan等通過(guò)在兔感染模型中使用與GluV8快速裂解的金黃色葡萄球菌表面結(jié)合的抗體來(lái)評(píng)估這種方法。作者表明，使用類(lèi)似于抗體鉸鏈序列的肽進(jìn)行免疫可引起特異性識(shí)別gluv8裂解抗體的強(qiáng)抗體反應(yīng)。與未免疫組相比，用鉸鏈樣肽免疫的兔的金黃色葡萄球菌定植水平降低，并且在體外試驗(yàn)中，這些動(dòng)物的血清恢復(fù)了補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性。

Figure 2  Antibodies that resist pathogenic protease activities to sustain recognition by host immune proteins, such as the C1q component of complement and CD32a Fc receptor found on phagocytes. (a) Antibodies recognizing hinge epitopes exposed after cleavage restore Fc functions to cleaved antibodies. (b) Antibodies with engineered hinge regions no longer serve as suitable substrates for pathogenic proteases. (c) Antibodies that block the activity of pathogenic proteases by directly blocking access to the active site (shown) or noncompetitive allosteric mechanisms (not shown) can protect antibody functions. Shown is the structure of LasB (PDB 3DBK). Adapted from images created with BioRender.
構(gòu)建抗裂解抗體是對(duì)抗蛋白水解降解的另一種策略。雖然IgG1是人體內(nèi)含量最多的同種型，也是藥物性抗體最常見(jiàn)的同種型，但IgG2通常對(duì)蛋白水解性裂解更有抗性。然而，與IgG1相比，IgG2與CD16a和C1q的結(jié)合更弱，并相應(yīng)地介導(dǎo)減少Fc依賴性殺傷和補(bǔ)體沉積。將IgG2的彈性與IgG1的功能相結(jié)合的努力導(dǎo)致了嵌合體，其中IgG2的下鉸鏈和CH2序列取代了IgG1的。然而，抗體也通過(guò)在保守的下端鉸鏈與經(jīng)典Fc受體結(jié)合，這一區(qū)域是許多蛋白酶的底物。因此，增加抗體抗裂解能力的突變也對(duì)Fc受體結(jié)合和免疫效應(yīng)功能的募集產(chǎn)生負(fù)面影響。

為了解決對(duì)抗體蛋白酶抗性的需求，同時(shí)保留效應(yīng)物的功能，我們產(chǎn)生了IgG1/IgG2混合抗體。Kinder等首先通過(guò)引入E233P/L234V/L235A替換和刪除Gly236，將IgG2的下鉸鏈引入到IgG1中。正如預(yù)期的那樣，在體外試驗(yàn)中，這種結(jié)構(gòu)失去了促進(jìn)補(bǔ)體殺傷和吞噬的能力。之前確定的選擇性激活補(bǔ)體殺傷或調(diào)理吞噬作用的突變隨后被引入該嵌合體。變異體2h-DE (S239D/I332E)恢復(fù)了Fc受體結(jié)合，而變異體2h-AA (K326A/E333A)恢復(fù)了補(bǔ)體殺傷。結(jié)合這些突變產(chǎn)生2h-DAA (239D/K326A/E333A)和2h-AEA (K326A/I332E/E333A)恢復(fù)了補(bǔ)體殺傷和調(diào)理吞噬活性，同時(shí)保持了對(duì)多種蛋白酶(化膿性鏈球菌IdeS、金黃色葡萄球菌GluV8、MMP-3和MMP-12)切割的抗性(圖2b)。蛋白酶耐藥Fc結(jié)構(gòu)域的加入可能支持藥物性抗體的開(kāi)發(fā)，以用于細(xì)菌感染(細(xì)菌感染的庫(kù)中包括抗體降解蛋白酶)。

用中和抗體直接靶向蛋白酶是阻斷蛋白水解活性的一種替代方法，具有阻斷所有底物裂解的優(yōu)點(diǎn)。這種方法最初用于腫瘤相關(guān)的MMPs，從而鑒定出Kivalues ~ 5 nM(78)作為競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑的抗體。它擴(kuò)展到銅綠假單胞菌假溶素(LasB)蛋白酶，該酶通過(guò)切割彈性蛋白、膠原、IgA、IgG和補(bǔ)體蛋白來(lái)支持早期感染


抗蛋白水解裂解的抗體可能提高其保護(hù)能力，并且可以通過(guò)識(shí)別抗降解的Fc取代來(lái)實(shí)現(xiàn)。重組抗體工程的一個(gè)吸引人的特點(diǎn)是，一旦開(kāi)發(fā)出合適的工程Fc，它可以與結(jié)合任何抗原的Fab臂結(jié)合。或者，可以為每一種感興趣的蛋白酶開(kāi)發(fā)酶抑制抗體。如果得到單克隆抗體研究的支持，經(jīng)過(guò)適當(dāng)工程改造的蛋白酶免疫原可增強(qiáng)天然抗體和疫苗誘導(dǎo)的多克隆抗體產(chǎn)生的保護(hù)作用。

阻斷細(xì)菌fc結(jié)合蛋白質(zhì)類(lèi)的抗體
各種細(xì)菌病原體表達(dá)與保守抗體序列結(jié)合的毒力因子。這些捕獲的抗體可以屏蔽病原體，阻斷免疫對(duì)其他表面抗原的接觸，拮抗Fc效應(yīng)功能，甚至改變免疫細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)。雖然多種生物分泌抗體結(jié)合蛋白，包括金黃色葡萄球菌第二免疫球蛋白結(jié)合蛋白(Sbi)、化膿性葡萄球菌蛋白G和M以及大胃鏈球菌蛋白L，但研究最多的是金黃色葡萄球菌蛋白A。蛋白A在所有定植株中均有表達(dá)，由5個(gè)同源結(jié)構(gòu)域組成，每個(gè)同源結(jié)構(gòu)域均能與除IgG3以外的所有人類(lèi)IgG同型和除IgG1以外的所有小鼠IgG同型的Fc高親和力結(jié)合(KD值為2.6-14 nM)。
當(dāng)?shù)鞍?/font>A通過(guò)c端錨定附著于細(xì)菌細(xì)胞壁時(shí)，可阻斷抗葡萄球菌抗體對(duì)表面抗原的接觸。它還通過(guò)干擾IgG六聚體形成和通過(guò)空間阻斷Fc與低親和力Fc受體的相互作用(Figure 5)來(lái)防止抗體依賴性補(bǔ)體激活。

Figure 5  Antibodies that target intracellular pathogens. (a) Antibody–antibiotic conjugates bind bacterial surface antigens and are internalized with the bacteria by natural or phagocytic mechanisms. Once internalized, the antibiotic is released by resident enzymes to kill co-localized bacteria. (b) Bispecific antibody MEDI3902 uses one binding site to bind the Psl surface antigen on Pseudomonas aeruginosa and mediate phagocytosis. After translocation to the endosome, the second antibody-binding site blocks type III secretion to support endosome acidification and bacterial killing. (c) The mannose-6-phosphate receptor can mediate antibody transfer to an endolysosome that may already contain Ebola virions. Once co-localized, the antibody can block Ebola–receptor interactions to prevent viral escape into the cellular cytosol. Adapted from images created with BioRender.

此外，一些蛋白A從細(xì)菌表面釋放，可與vh3型b細(xì)胞受體或抗體Fc結(jié)構(gòu)域結(jié)合。B細(xì)胞受體交聯(lián)激活B細(xì)胞，導(dǎo)致克隆擴(kuò)增和凋亡塌陷，從而限制抗葡萄球菌應(yīng)答(Figure 3b)。與游離抗體的Fc結(jié)構(gòu)域結(jié)合可以在細(xì)胞循環(huán)過(guò)程中阻斷與新生兒Fc受體(FcRn)的相互作用，從而靶向抗體進(jìn)行溶酶體降解(Figure 3c)。

Figure 3  Antibodies that resist capture by Fc-binding protein A. Staphylococcus aureus protein A disrupts antibody responses in multiple ways but can be restored by Fc domains with reduced protein A affinity (most IgG3 allotypes or engineered IgG1 domains) or antibodies that bind protein A to block Fc capture. (a) Membrane-bound protein A can block antibody Fc binding to the low-affinity Fc receptors CD16b and CD32a, block the Fc hexamerization required for efficient recruitment of C1q to activate complement, and shield the bacterial surface from recognition by antibody Fab domains. Secreted protein A can (b) crosslink VH3 domains to trigger B cell receptor activation and apoptotic collapse and (c) block antibody recycling by Fc/FcRn binding to reduce antibody half-life. Unmodified antibodies are shown in green, Fc engineered antibodies are shown in yellow, and antiprotein A antibodies are shown in orange. Abbreviations: Ab, antibody; FcRn, neonatal Fc receptor. Adapted from images created with BioRender.
已經(jīng)探索了用單克隆抗體的抗原結(jié)合抗原表位直接靶向蛋白A，以阻斷其Fc結(jié)合活性，支持細(xì)菌的調(diào)理吞噬作用。抗體514G3與在有血清抗體的情況下細(xì)菌表面可接近的蛋白a表位結(jié)合。在小鼠模型中，在耐甲氧西林金黃色葡萄球菌致死性攻擊前給藥時(shí)，該抗體顯示出保護(hù)作用，而較低的抗體劑量與萬(wàn)古霉素抗生素治療顯示出協(xié)同作用。
抗體3F6與蛋白A和相關(guān)蛋白Sbi結(jié)合，阻斷Fc捕獲和B細(xì)胞交聯(lián)效應(yīng)(Figure3b)。用3F6作為小鼠IgG2a進(jìn)行被動(dòng)免疫可保護(hù)新生小鼠免受血流感染，并使其血清中針對(duì)其他金黃色葡萄球菌抗原的IgG滴度較高。

人們一直在努力設(shè)計(jì)能引起強(qiáng)512G3和3f6樣蛋白A應(yīng)答的抗原，目的是降低蛋白A對(duì)Fc的親和力。與野生型蛋白A不同，一個(gè)名為SpAKKAA的初始解毒變異體，SpAKKAA免疫可誘導(dǎo)產(chǎn)生高滴度抗體，從而促進(jìn)調(diào)理吞噬細(xì)胞殺傷，并保護(hù)小鼠免受金黃色葡萄球菌血流感染。然而，SpAKKAA持續(xù)引起動(dòng)物應(yīng)激，提示其保留了部分B細(xì)胞超抗原活性。SpAKKAA等免疫原能更好地誘導(dǎo)抗體干擾蛋白A的功能，因?yàn)榧词乖贔c存在的情況下，關(guān)鍵表位仍然暴露。這種方法為設(shè)計(jì)其他Fc結(jié)合蛋白的免疫原提供了希望。

抗Fc結(jié)合蛋白捕獲的抗體
為了支持開(kāi)發(fā)用于疾病的單克隆抗體，可以對(duì)抗體Fc結(jié)構(gòu)域進(jìn)行改造，以降低對(duì)致病性Fc結(jié)合蛋白的親和力。先前的研究表明，由于聚焦化或氨基酸序列的改變，抗體對(duì)活化的CD16a和CD32a宿主受體具有更高的親和力，從而增強(qiáng)了與癌癥相關(guān)的效應(yīng)功能。然而，這些和相關(guān)的Fc變化對(duì)感染性疾病反應(yīng)的潛在影響還不太清楚。

為了確定抗蛋白A捕獲的抗體是否介導(dǎo)了更強(qiáng)的金黃色葡萄球菌吞噬作用，我們選擇了一種與豐富的表面糖共聚物壁磷壁酸結(jié)合的抗體。兩個(gè)降低蛋白A結(jié)合親和力的殘基改變(H435R和Y436F)被引入人IgG1 Fc結(jié)構(gòu)域。類(lèi)似Fc結(jié)合蛋白由皰疹病毒表達(dá)，當(dāng)這些病毒Fc受體在感染細(xì)胞表面表達(dá)時(shí)，它們可以捕獲與鄰近病毒糖蛋白結(jié)合的抗體Fc結(jié)構(gòu)域。
這種拮抗作用可抑制Fc與免疫細(xì)胞上的宿主Fc受體的結(jié)合和信號(hào)傳導(dǎo)，并可導(dǎo)致抗體內(nèi)化，用于溶酶體降解或重新包裝，使抗體覆蓋病毒粒子。同樣，當(dāng)使用缺乏病毒Fc受體的病毒株感染成纖維細(xì)胞時(shí)，結(jié)合巨細(xì)胞病毒蛋白的抗體結(jié)合人Fc受體，并更有效地誘導(dǎo)ADCC。這表明，Fc結(jié)構(gòu)域可以被設(shè)計(jì)來(lái)增強(qiáng)非中和性抗皰疹病毒應(yīng)答(如ADCC)的效力。

防止病原體隔離抗體可以使宿主免疫系統(tǒng)有效地應(yīng)對(duì)感染。在金黃色葡萄球菌中，抗體514G3阻斷了蛋白A與任何抗體Fc的結(jié)合，而使用IgG3 Fc可防止蛋白A破壞治療性抗體活性。這些報(bào)告為靶向蛋白A的抗體提供了概念驗(yàn)證，可能擴(kuò)展到其他Fc結(jié)合蛋白。結(jié)合重組抗體技術(shù)的進(jìn)步，我們認(rèn)為利用抗體逃逸途徑的知識(shí)開(kāi)發(fā)設(shè)計(jì)Fc結(jié)構(gòu)域可介導(dǎo)針對(duì)特定病原體的有效效應(yīng)功能。