用于分子診斷和疾病的單克隆抗體
廣泛應(yīng)用于抗原檢測(cè)和人類疾病的抗體因其高度特異性和低毒性使成為了極具前景的醫(yī)藥商品。實(shí)際上，它們是僅次于疫苗的第二大臨床開(kāi)發(fā)生物藥品類別。自1997年FDA批準(zhǔn)首個(gè)抗體藥——抗cd20嵌合抗體利妥昔單抗以來(lái)，利妥昔單抗已成為許多非霍奇金淋巴瘤治療策略的組成部分。
單克隆抗體通常通過(guò)用抗原免疫實(shí)驗(yàn)動(dòng)物(如小鼠)獲得，篩選得到一株產(chǎn)生特異性抗體的雜交瘤。雜交瘤技術(shù)是最常用的單克隆抗體制備技術(shù)之一，但由于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物免疫系統(tǒng)存在偏差，這限制了獲得針對(duì)保守哺乳動(dòng)物蛋白的高親和力抗體的能力。尤其是在應(yīng)用于針對(duì)人類的治療性抗體的領(lǐng)域，這些蛋白質(zhì)的異源性通常使它們對(duì)人類具有免疫原性，從而引發(fā)HAMA反應(yīng)(人類抗小鼠抗體)。
抗體人源化繞開(kāi)了這一瓶頸，通過(guò)用人框架同源序列替換小鼠序列來(lái)最大限度地減少HAMA應(yīng)答。人源化抗體已成為當(dāng)今許多疾病治療的現(xiàn)實(shí)，包括癌癥的治療和診斷。然而，一些應(yīng)用可能會(huì)受到其分子大小的限制。它們對(duì)組織(如實(shí)體瘤)的穿透性較差，并且通過(guò)空間約束與某些分子表面的功能重要區(qū)域結(jié)合較差或不結(jié)合?？贵w片段，如Fab(片段抗原結(jié)合)，scFv(單鏈可變片段)是減少抗體大小和增加其滲透到組織的替代方案，納米抗體的出現(xiàn)完美解決了這一難題。

構(gòu)建和篩選絲狀噬菌體表面人源抗體組合文庫(kù)是獲得人源抗體及其片段的適宜方法。這些文庫(kù)可以是合成的，也可以從人類患者的庫(kù)中獲得，結(jié)合物的選擇是針對(duì)之前定義的配體，從而產(chǎn)生完全人源性抗體片段，理論上的免疫原性低于鼠源或人源化抗體片段?？贵w噬菌體展示技術(shù)為研究、診斷和治療提供了大量的人源重組抗體。2003年，F(xiàn)DA批準(zhǔn)了第一種噬菌體展示抗體阿達(dá)木單抗(Adalimumab)用于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。目前，它還廣泛用于銀屑病、關(guān)節(jié)炎、強(qiáng)直性脊柱炎和克羅恩病。接下來(lái)我們將主要梳理來(lái)自幼稚細(xì)胞或免疫文庫(kù)的Fab、scFv、sdAb或其他抗體片段的例子。

抗體噬菌體展示庫(kù)
噬菌體展示技術(shù)由George P.Smith于1985年提出，描述外源肽在噬菌體顆粒表面的呈現(xiàn)。這是基于觀察到，來(lái)自Inoviridae家族的噬菌體(M3,fd,fl)經(jīng)過(guò)適當(dāng)包裝，即使在外源肽與其衣殼蛋白融合的情況下仍保持感染性。通過(guò)基因操作獲得噬菌體展示文庫(kù)。數(shù)以億計(jì)的肽、蛋白變體、抗體片段編碼基因被克隆到一個(gè)融合到絲狀噬菌體外殼蛋白(pIII或pVIII)基因5'的載體中。這些噬菌體庫(kù)被用來(lái)轉(zhuǎn)化細(xì)菌，這些細(xì)菌也會(huì)被輔助噬菌體感染。輔助噬菌體感染使病毒顆粒在其表面顯示融合蛋白。由于外殼蛋白僅為展示肽提供錨定，因此不應(yīng)干擾其結(jié)構(gòu)，并允許肽及其相應(yīng)基因的親和純化。這一原理也適用于抗體片段在絲狀噬菌體表面的呈遞。


可以采用不同的策略獲得抗體組合噬菌體展示文庫(kù)。根據(jù)人類可變輕庫(kù)(VL)和可變重庫(kù)(VH)構(gòu)建了一些合成或半合成文庫(kù)。最常用的是Griffin-1文庫(kù)，它由體內(nèi)使用的大部分人類VH和VL基因片段組成，使用合成的寡核苷酸產(chǎn)生更多的CDR3多樣性(半合成)，以及Tomlinson I文庫(kù)，它由單一的人類框架組成，多樣性包含在VH和VL結(jié)構(gòu)域的18個(gè)氨基酸位置，主要位于抗原結(jié)合位點(diǎn)(合成)。在這兩個(gè)庫(kù)中，抗體均顯示為scFvs。從這些文庫(kù)中獲得了幾種人抗體，單獨(dú)或聯(lián)合用于生物淘洗工藝。另一種策略是通過(guò)擴(kuò)增一個(gè)或多個(gè)個(gè)體的可變基因庫(kù)來(lái)構(gòu)建文庫(kù)。為此，我們使用了覆蓋所有V基因家族的引物，文庫(kù)由VL和VH鏈編碼基因隨機(jī)組合而成。同樣，抗體編碼基因被組裝成Fab或scFv抗體片段。從理論上講，每個(gè)克隆都編碼一個(gè)特定的抗原結(jié)合位點(diǎn)，該位點(diǎn)來(lái)自于通過(guò)人工結(jié)構(gòu)域外推原始結(jié)構(gòu)域而增加的自然結(jié)構(gòu)域。

淘選過(guò)程在體外模擬了B細(xì)胞克隆篩選系統(tǒng)，方法是特異性富集具有所需特異性抗體的噬菌體顆粒。在建庫(kù)過(guò)程中，確保庫(kù)的多樣化是很重要的，因此庫(kù)的大小對(duì)于嘗試為任何特定抗原選擇結(jié)合形式的有效性是至關(guān)重要的。組合抗體庫(kù)可以從免疫或未免疫的供體中構(gòu)建。可選擇提供針對(duì)不同類型抗原的高親和力抗體:半抗原、蛋白質(zhì)、多肽和碳水化合物
篩選方法大多基于4個(gè)主要步驟:制備噬菌體展示文庫(kù)，吸附特異性結(jié)合噬菌體，去除非特異性或低親和力噬菌體，回收目標(biāo)結(jié)合物，細(xì)菌感染后再擴(kuò)增，進(jìn)行下一輪篩選。篩選過(guò)程導(dǎo)致噬菌體與所選的純或不純抗原特異性結(jié)合的順序富集。這些篩選步驟將重復(fù)3-5次，直到鑒定出高特異性/親和力的結(jié)合物。
普健生物噬菌體展示抗體發(fā)現(xiàn)平臺(tái)具有強(qiáng)大的篩選能力，滿足高通量抗體開(kāi)發(fā)需求，擁有包括隨機(jī)肽庫(kù)、免疫庫(kù)和天然庫(kù)在內(nèi)的千億級(jí)庫(kù)容，可以構(gòu)建多物種（人源、小鼠、兔子、羊駝等）抗體文庫(kù)以及多種類型（scfv、Fab、VHH 等）的抗體文庫(kù)。

選擇細(xì)胞表面的噬菌體是發(fā)展腫瘤靶向治療的重要一步。它為獲得針對(duì)未知和非免疫原性細(xì)胞表面抗原的抗體提供了機(jī)會(huì)。隨著靶抗原越來(lái)越復(fù)雜，如細(xì)胞表面，選擇過(guò)程變得更加困難。細(xì)胞膜上有大量的蛋白質(zhì)、碳水化合物和脂類作為潛在抗原。它們的表達(dá)水平可因細(xì)胞而異，這使得相關(guān)抗原在所有細(xì)胞膜成分中存在的量很小。因此，每一輪的選擇都需要相對(duì)大量的細(xì)胞，這使得該技術(shù)對(duì)于通常從器官和組織中獲得的小細(xì)胞群的應(yīng)用變得困難。但噬菌體展示文庫(kù)在這里就體現(xiàn)出了強(qiáng)大的應(yīng)用前景。

普健生物噬菌體文庫(kù)的類型
隨機(jī)肽庫(kù)：將化學(xué)合成的隨機(jī)寡核苷酸序列與噬菌體的表面蛋白基因融合，在噬菌體表面表達(dá)出各種氨基酸組合的 隨機(jī)序列短肽。利用噬菌體展示隨機(jī)肽庫(kù)可以高通量篩選各種抗原的抗原表位
免疫庫(kù)：免疫庫(kù)由經(jīng)過(guò)免疫 ( 包括疫苗注射、微生物感染、自身免疫疾病、腫瘤等 ) 后的供體 B 淋巴細(xì)胞的抗體 基因構(gòu)建。對(duì)于特定免疫抗原的抗體淘選的效率較高，但一般僅適用于一種特異性抗體的選擇，庫(kù)容量要求不高，一般
10⁶-10⁸的庫(kù)容量就可滿足需要
天然庫(kù)：采用不經(jīng)免疫的人或動(dòng)物來(lái)源的外周血淋巴細(xì)胞、骨髓、脾細(xì)胞的 B 細(xì)胞作為材料，進(jìn)行基因擴(kuò)增，但親 和力通常較低。骨髓內(nèi)和骨髓外所有抗體基因都包含在內(nèi)，所構(gòu)建的抗體庫(kù)適用于所有抗原所對(duì)應(yīng)的抗體的選擇，庫(kù)容 量要求較高，最小需要達(dá)到 109 ，因?yàn)槟壳肮浪愕淖匀唤绲目乖N類在這個(gè)數(shù)量級(jí)上

普健生物噬菌體展示技術(shù)平臺(tái)優(yōu)勢(shì)
1. 豐富的噬菌體抗體技術(shù)經(jīng)驗(yàn)，五年以上噬菌體抗體開(kāi)發(fā)，交付上百個(gè)噬菌體展示抗體開(kāi)發(fā)項(xiàng)目
2. 具有全人源重組抗體庫(kù)，庫(kù)容高達(dá)千億級(jí)別（1011 pfu)，兩步建庫(kù)法，保證了文庫(kù)的多樣性，抗體庫(kù)片段插入
正確率高；可以兩周拿到全人源重組抗體
3. 可以構(gòu)建多物種（人源、小鼠、兔子、羊駝等）抗體文庫(kù)
4. 可以構(gòu)建多種類型（scfv、Fab、VHH 等）的抗體文庫(kù)


噬菌體展示技術(shù)為快速發(fā)現(xiàn)腫瘤抗原抗體提供了有力的手段。它容易實(shí)現(xiàn)，操作方便，成功率高。與小鼠雜交瘤技術(shù)產(chǎn)生的抗體相比，噬菌體展示技術(shù)抗體的優(yōu)點(diǎn)是直接分離出全人源抗體，而小鼠雜交瘤技術(shù)需要費(fèi)力地將候選引物人源化。目前，許多噬菌體展示抗體已進(jìn)入生物制藥市場(chǎng)。單克隆抗體通過(guò)調(diào)節(jié)固有的腫瘤細(xì)胞通路和激活針對(duì)腫瘤細(xì)胞的固有免疫反應(yīng)，已成為標(biāo)準(zhǔn)的抗癌藥物。顯然，噬菌體展示技術(shù)衍生的人類抗體可以與早期產(chǎn)品競(jìng)爭(zhēng)，只要它們針對(duì)的是明確定義的靶點(diǎn)，如EGFR或VEGF通路。噬菌體展示技術(shù)在藥物研發(fā)中發(fā)揮著重要作用，許多噬菌體分子已獲得FDA批準(zhǔn)，許多噬菌體分子已進(jìn)入臨床試驗(yàn)。我們可以期待，在不久的將來(lái)會(huì)有更大的改進(jìn)，噬菌體展示將為腫瘤學(xué)帶來(lái)更多的貢獻(xiàn)。


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